קביעת פעילות הקרישה של שלפוחית חוץ-תאית (EV) באמצעות זמן קרישה המופעל על ידי EV (EV-ACT)

Summary

פרוטוקול זה חוקר את השימוש בפלזמה עשירה בשלפוחית חוץ-תאית (EV) כאינדיקטור ליכולת הקרישה של EV. פלזמה עשירה ב- EV מתקבלת באמצעות תהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית והסתיידות לאחר מכן.

Abstract

תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) במחלות שונות זוכה לתשומת לב מוגברת, במיוחד בשל פעילותן החזקה כחומר קרישה. עם זאת, יש צורך דחוף בבדיקה ליד המיטה כדי להעריך את פעילות הקרישה של EV במסגרות קליניות. מחקר זה מציע להשתמש בזמן הפעלת תרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי כמדד לפעילות הקרישה של EV. נהלים סטנדרטיים ננקטו כדי להשיג דם שלם נתרן ציטרלי, ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לקבל פלזמה עשירה EV. הפלזמה העשירה ברכב חשמלי וסידן כלורי נוספו לכוס הבדיקה, והשינויים בצמיגות נוטרו בזמן אמת באמצעות אנלייזר. זמן הקרישה הטבעי של פלזמה עשירה ב-EV, המכונה EV-ACT, נקבע. התוצאות הראו עלייה משמעותית ב-EV-ACT כאשר EV הוסר מפלזמה שהתקבלה ממתנדבים בריאים, בעוד שהיא ירדה משמעותית כאשר EV הועשר. יתר על כן, EV-ACT קוצר במידה ניכרת בדגימות אנושיות מרעלת הריון, שבר בירך וסרטן ריאות, מה שמצביע על רמות גבוהות של EV פלזמה וקידום קרישת יתר בדם. עם ההליך הפשוט והמהיר שלו, EV-ACT מראה הבטחה כמבחן ליד המיטה להערכת תפקוד הקרישה בחולים עם רמות גבוהות של EV בפלזמה.

Introduction

פקקת, הנגרמת על ידי קרישיות יתר, ממלאת תפקיד משמעותי במחלות שונות, כולל טראומה מוחית¹, רעלת הריון², גידולים³ וחולי שבר⁴. המנגנון העומד בבסיס קרישיות יתר הוא מורכב, ולאחרונה הושם דגש על תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) בהפרעות קרישה. כלי רכב חשמליים הם גופים דמויי שלפוחית בעלי מבנה דו-שכבתי המתנתקים מקרום התא, בקוטר שבין 10 ננומטר ל-1000 ננומטר. הם קשורים למגוון תהליכי מחלה, במיוחד הפרעות קרישה⁵. מספר מחקרים זיהו רכבים חשמליים כמנבא מבטיח לסיכון לפקקת ^6,7. פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים תלויה בביטוי של גורמי קרישה, בעיקר גורם רקמה (TF) ופוספטידיל-סרין (PS). כלי רכב חשמליים בעלי פעילות פרוקוגנטית חזקה משפרים באופן משמעותי את היעילות הקטליטית של טנאז וקומפלקס פרותרומבין, ובכך מקדמים פיברינוגן בתיווך טרומבין ופקקת מקומית⁸. רמות גבוהות של כלי רכב חשמליים והקשר הסיבתי שלהם עם קרישיות יתר נצפו במחלות רבות⁹. לפיכך, סטנדרטיזציה של זיהוי כלי רכב חשמליים ודיווח על פעילותם המונעת קרישה היא תחום חשוב בחקירה¹⁰.

נכון להיום, רק ערכות מסחריות מעטות זמינות לאיתור פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים. בדיקת MP-Activity ובדיקת MP-TF, המיוצרת על ידי חברה מסחרית, הן בדיקות פונקציונליות המשמשות למדידת פעילות הקרישה של EV בפלזמה¹¹. בדיקות אלה משתמשות בעיקרון דומה לזה של בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים כדי לזהות PS ו- TF על כלי רכב חשמליים. עם זאת, ערכות אלה יקרות ומוגבלות למספר מוסדות מחקר ברמה גבוהה. התהליך מורכב וגוזל זמן, ולכן קשה ליישם אותם במסגרות קליניות. בנוסף, בדיקת פוספוליפיד מקרישה (PPL) שפותחה באופן מסחרי מערבבת פלזמה נטולת PS עם פלסמת בדיקה, ומודדת את זמן הקרישה כדי לזהות כמותית רמות של PS-positive EVs¹². עם זאת, בדיקות אלה מתמקדות בעיקר ב-PS וב-TF על כלי רכב חשמליים, תוך התעלמות ממסלולי קרישה אחרים שבהם כלי רכב חשמליים עשויים להיות מעורבים^ב-12.

מערכת קרישת הפלזמה מורכבת וכוללת רכיבים "בלתי נראים" ו"נראים", כולל חומרי קרישה, נוגדי קרישה, מערכות פיברינוליטיות ורכבים חשמליים המרחפים בפלזמה. מבחינה פיזיולוגית, רכיבים אלה שומרים על איזון דינמי. במצבים פתולוגיים, עלייה משמעותית במחזור הדם של כלי רכב חשמליים תורמת לקרישיות יתר, במיוחד בחולים עם טראומה מוחית, רעלת הריון, שברים וסוגים שונים של סרטן¹³. כיום, הערכת מצב הקרישה במעבדות קליניות כוללת בעיקר הערכת מערכת הקרישה, מערכת נוגדי הקרישה ופיברינוליזה 14,15,16,17. זמן פרותרומבין, זמן תרומבופלסטין חלקי פעיל, זמן תרומבין ויחס מנורמל בינלאומי משמשים בדרך כלל להערכת רמות פקטורי הקרישה במערכת הקרישה¹⁸. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי בדיקות אלה אינן משקפות באופן מלא את קרישיות יתר של מחלות מסוימות¹⁹. שיטות בדיקה אחרות, כגון טרומבואלסטומטריה (TEG), TEG סיבובי וניתוח סונוקרוט מודדות שינויים ויסקו-אלסטיים בדם מלא^20,21. מכיוון שדגימות דם שלמות מכילות תאי דם וטסיות דם רבים, בדיקות אלה נוטות יותר להצביע על מצב הקרישה של הדגימה בכללותה. כמה חוקרים דיווחו על תפקידם של תאי דם וטסיות בפעילות קרישה^22,23. מחקר שנערך לאחרונה גילה גם כי בדיקות קודמות של תפקודי קרישה נתקלות בקשיים באיתור שינויים בפעילות הקרישה של מיקרו-חלקיקים²⁴. לכן, הוצעה השערה כי ניתן להעריך את פונקציית הקרישה של כלי רכב חשמליים על ידי מדידות ויסקו-אלסטיות של זמן הקרישה הפעיל (ACT) בפלזמה עשירה ב-EV.

Protocol

איסוף דגימות האדם אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הכללי של האוניברסיטה הרפואית בטיאן-ג'ין. איסוף הדם הוורידי האנושי עקב בקפדנות אחר ההנחיה שפורסמה על ידי ועדת הבריאות הלאומית של סין, כלומר WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. בקצרה, נאסף דם מאנשים בריאים בהסכמה מדעת מווריד האזור הברכיאלי הקדמי, והדגימות עורבבו באמצעות נוגד קרישה נתרן ציטראט 3.2% ביחס של 1:9. כאשר נאספו רק דגימות נוגדות קרישה של נתרן ציטראט, כלי האיסוף הראשון הושלך לפח. זרימת העיבוד החלה תוך 0.5 שעות מאיסוף הדגימה. נבדקים בריאים בוגרים גויסו לאיסוף דגימות לאחר קבלת הסכמה מדעת. קריטריוני אי הכללת המטופל היו: (1) פקקת תוך וסקולרית לאחרונה, (2) פגיעה בתפקוד הכבד והכליות, (3) יתר לחץ דם, היפרליפידמיה, סוכרת ומחלות כרוניות אחרות, (4) טיפול באספירין או נוגדי קרישה, (5) וסת והריון.

1. בידוד פלזמה עשירה ברכב חשמלי

1. צנטריפוגה את הדגימות ב 120 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר תאי דם. הסופרנאטנט הוא פלזמה עשירה בטסיות. לאחר מכן, מעבירים את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש עם פיפטה.
2. צנטריפוגה את הפלזמה עשירה טסיות ב 1500 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את טסיות. הסופרנאטנט הוא פלזמה ענייה בטסיות. לאחר מכן מעבירים את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש.
3. צנטריפוגה את הפלזמה ענייה טסיות ב 13000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת התא. הסופרנאטנט הוא פלזמה עשירה ב-EV. לאחר מכן, העבירו את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש לבדיקה הבאה.

2. זיהוי EV-ACT של הדגימה על ידי המנתח

1. הפעל את מנתח הקריש (ראה טבלת חומרים) וחמם את המכשיר ל- 37 מעלות צלזיוס. התקן את הבדיקה החד פעמית ואת הבדיקה ולאחר מכן התחל את הליך בקרת האיכות של המכונה.
   הערה: כאשר ערך אות ההתנגדות הצמיגה על המסך מוצג כקו ישר, פירוש הדבר שהזיהוי אינו מופרע ובקרת האיכות של מצב המנתח מוסמכת. ניתן להתחיל בהליך הבדיקה לאחר אישור הבדיקה העצמית.
2. הזן מידע לדוגמה במערכת. לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר של פלזמה עשירה ברכב חשמלי לכוס הבדיקה, ולאחר מכן 20 מילימטר 170 מיקרוליטר של סידן כלורי. לחץ על לחצן התחל. מוט הערבוב המגנטי בכוס הבדיקה יערבב באופן מלא את הדגימה עם סידן כלורי. סגור את הכיסוי, והבדיקה תתחיל לזהות את השינוי בהתנגדות הדגימה.
   הערה: לאחר סיום הבדיקה, המנתח יבקש באופן אוטומטי "הבדיקה הושלמה". הזמן של EV-ACT מוצג ונרשם על ידי המערכת. התוצאה באה לידי ביטוי ביחידת הזמן "שנייה". השליכו את הבדיקה ובדקו את הכוס.

3. בקרת איכות מבוססת ציטומטריה של זרימה של דגימת פלזמה עשירה ברכב חשמלי

1. כלי רכב חשמליים זוהו לראשונה לפי גודלם (0.1-1 מיקרומטר). התאם מראש את הפרמטרים של ציטומטר הזרימה והגדר את "השער" של EV באמצעות חרוזי פוליסטירן הזמינים מסחרית (0.5, 0.9 ו- 3.0 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים).
   הערה: תערובת החרוזים מורכבת מכדורי פלורסנט בקטרים שונים המכסים את טווח הגדלים של מיקרו-שלפוחיות (0.5 ו-0.9 מיקרומטר) וטסיות דם (0.9 מיקרומטר ו-3 מיקרומטר).
2. כוונן את המתח של הפיזור הקדמי והפיזור הצדדי, וודא שהמיקרוספרות בגודל 0.9 מיקרומטר נופלות באזור המתאים. ניתן לצייר את אזור הרכב החשמלי על פי קוטר המיקרספרה.
3. העבירו 50 μL של פלזמה עשירה ב-EV לתוך צינור הזרימה, ולאחר מכן 450 μL של מלח חיץ פוספט מסונן. מערבבים היטב את הנוזל בצינור הזרימה. לבסוף, זהה את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה²⁵.
4. השתמש בחלקיקים פלואורסצנטיים של קשת אולטרה (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת את מספר EVs.In הקצר, הוסף 10 μL של החלקיקים לדגימה לפני זיהוי הזרימה, וחשב את ריכוז EV באמצעות הנוסחה הבאה לאחר השלמת זיהוי הדגימה: 10,120 * EV (#) / (microbeads * נפח) * גורם דילול²⁶.

תוצאות

זמן הפעלת הטרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי נמדד באמצעות מנתח שיטה ויסקו-אלסטית למדידת זמן קרישת פלזמה. המכונה מורכבת מארבעה רכיבים עיקריים: ממיר אותות אלקטרוניים, גשוש, מיכל גילוי וגוף חימום (איור 1A,B). הגשושית משתמשת בתנודות בתדירות גבוהה ומשרעת נמוכה כדי לזהות ...

Discussion

במחקר זה תוארה הכנת פלזמה עשירה ב-EV, ורציונליות השיטה אומתה באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, דגימות הפלזמה המסוידות נותחו במשך זמן ACT באמצעות מנתח קריש המבוסס על עקרונות צמיגות²⁴. כפי שניתן לראות באיור 3A, נמצא כי ריכוז כלי הרכב החשמליים המתקבלים באמצעות אולט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.