نقدم هنا بروتوكولا لزراعة أنواع فرعية محددة من الخلايا تحت المهاد في الثقافة. يمكن اختيار الخلايا بناء على علامات الغشاء المناسبة / الفريدة واستخدامها في العديد من التطبيقات ، بما في ذلك المقايسات المناعية والفيزيولوجية الكهربية والكيميائية الحيوية.
ينظم ما تحت المهاد عمليات التمثيل الغذائي الأساسية من خلال التحكم في وظائف متنوعة مثل تناول الطعام ودرجة حرارة الجسم وإطلاق الهرمونات. نظرا لأن وظائف منطقة ما تحت المهاد يتم التحكم فيها بواسطة مجموعات فرعية محددة من المجموعات العصبية ، فإن القدرة على عزلها توفر أداة رئيسية لدراسة آليات التمثيل الغذائي. في هذا الصدد ، يشكل التعقيد العصبي لما تحت المهاد تحديات استثنائية.
لهذه الأسباب ، تم استكشاف تقنيات جديدة ، مثل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). تصف هذه الورقة تطبيقا جديدا لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) باستخدام تقنية الميكروبيدات لعزل مجموعة الخلايا العصبية المستهدفة عن أدمغة الفئران قبل الولادة. هذه التقنية بسيطة وتضمن ثقافة الخلايا العصبية تحت المهاد الأولية النقية للغاية والقابلة للحياة مع قابلية عالية للاستنساخ. يتم فصل منطقة ما تحت المهاد بلطف ، ويتم عزل الخلايا العصبية بشكل انتقائي وفصلها عن الخلايا الدبقية ، وأخيرا ، باستخدام جسم مضاد محدد لعلامة سطح الخلية ، يتم اختيار السكان المعنيين.
بمجرد عزلها ، يمكن استخدام الخلايا العصبية المستهدفة للتحقق من خصائصها المورفولوجية والكهربائية والغدد الصماء واستجاباتها في الظروف الطبيعية أو المرضية. علاوة على ذلك ، نظرا للأدوار المتنوعة لما تحت المهاد في تنظيم التغذية والتمثيل الغذائي والإجهاد والنوم والتحفيز ، فإن إلقاء نظرة فاحصة على الخلايا العصبية المستهدفة والخاصة بالمنطقة قد يوفر نظرة ثاقبة لمهامها في هذه البيئة المعقدة.
منطقة ما تحت المهاد هي منطقة متعددة الجوانب في الدماغ تتوسط وظائف الغدد الصماء واللاإرادية والحشوية والسلوكية ، بما في ذلك التغذية والتمثيل الغذائي والنوم ودرجة حرارة الجسم والسلوك الاجتماعي والدافع الجنسي 1،2،3،4،5. يتم تحقيق عدم التجانس الوظيفي من خلال مزيج تآزري من الآليات الكيميائية الحيوية والكهربائية: تطلق الخلايا العصبية تحت المهاد إمكانات العمل وتفرز وتطلق الهرمونات والببتيدات العصبية لتعديل مناطق الدماغ وأعضاء الجسم. أخيرا ، تترجم الخلايا العصبية تحت المهاد رسائل الاستتباب من الجسم ، وتستجيب بردود فعل طويلة الأجل وقصيرة الأجل ولوائح التغذيةالأمامية 6.
تشمل البيئة العصبية المعقدة لما تحت المهاد الخلايا العصبية الغدد الصماء المغنطيسية ، وإطلاق الأوكسيتوسين والفاسوبريسين. الخلايا العصبية ذات الخلايا الصغيرة ، التي تشارك في المقام الأول في التنظيم الهرموني الجهازي ، والإفراج على سبيل المثال ، هرمون إطلاق هرمون الثيروتروبين (TRH) ، وهرمون إفراز الكورتيكوتروبين (CRH) إلى الغدة النخامية ؛ الخلايا العصبية الإسقاط الببتيدرجي الكبيرة ، والإفراج عن orexin وهرمون تركيز الميلانين (MCH) ؛ والخلايا العصبية الببتيدرجية الصغيرة من النواة المقوسة (ARC) التي تطلق POMC (proopiomelanocortin) و AgRP (بروتين مرتبط ب agouti) ، المسمى ARCPOMC و ARCAgRP ، على التوالي. جنبا إلى جنب مع الخلايا الإفرازية ، تشارك الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة الأخرى ، بما في ذلك الخلايا العصبية الدوبامينية ، والجلوتامينرجيك ، و GABAergic 7 ، في تشكيل دوائر داخل المهاد وخارج المهاد ، وبالتالي إنشاء شبكات منسقة واسعة النطاق من عدم التجانس الخلوي الكبير8.
كان التنوع تحت المهاد تحديا يحاول الباحثون التغلب عليه على مدار ال 50 عاما الماضية. لدراسة هذا عدم التجانس في مرحلة ما تحت المهاد النامية والناضجة والشيخوخة ، استخدم الباحثون ، من ناحية ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لاستكشاف تنظيم الخلايا العصبية ، بالإضافة إلى التوقيعات الجزيئية والنسخية. قدم هذا الجهد نظرة ثاقبة على الأدوار المتنوعة للخلايا العصبية تحت المهاد وتناول الروابط بين الهوية الخلوية ودورها المحتمل في النظام الفسيولوجي8،9،10. من ناحية أخرى ، تم التحقيق في الوظائف العصبية من خلال التلاعب البصري الوراثي والنهج السلوكية للقياس الضوئي للألياف ، مما يوفر نظرة فاحصة على بنية الدوائر. في العقدين الماضيين ، سمحت تقنية Cre-recombinase للباحثين بتحفيز أو تثبيط مجموعة مستهدفة من الخلايا العصبية وراثيا مع ملاحظة التغيرات في السلوكيات واستجابات الجسم6،11،12.
ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب تدرس وظائف ما تحت المهاد من منظور عام دون الغوص بشكل أعمق في الآليات الخلوية المحددة أو الأساس البيولوجي لدورها في بيئة ما تحت المهاد المعقدة. لمعالجة هذا الأمر ، ركز عدد قليل جدا من الدراسات على التحقيق في الخصائص الجزيئية والكيميائية الحيوية والكهربائية باستخدام الثقافات الأولية غير المتجانسة. سعت هذه الدراسات إلى تشريح عمليات عصبية محددة في بيئة معقدة وولدت نماذج تكاملية للآليات الفسيولوجية13،14،15. ومع ذلك، فإن الثقافات غير المحددة تشكل تحديات كبيرة. على سبيل المثال ، يتم تعطيل الاتصال الفسيولوجي للخلايا العصبية والتوزيع التشريحي عن طريق طلاء الخلايا العصبية من مناطق ما تحت المهاد المختلفة التي لا تتفاعل عادة ، مما يخلق تأثيرات مربكة. بالإضافة إلى ذلك ، لكل منطقة أدوار مختلفة ومجموعات عصبية متنوعة ، مما يجعل من الصعب دراسة العمليات البيولوجية البسيطة.
لمواجهة هذه التحديات ، في العقد الماضي ، تم تنفيذ مناهج جديدة لعزل الخلايا العصبية ذات الأهمية ، مثل الفرز المناعي ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) ، وفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). Immunopanning هي استراتيجية تستخدم لتنقية الخلايا المستهدفة باستخدام أطباق مغلفة بالأجسام المضادة لسلسلة من التحديدات غير العصبية (السلبية) والعصبية (الإيجابية). في حين أن هذه التقنية يمكن ، من حيث المبدأ ، أن تولد ثقافات خلايا نقية عالية الغلة ، إلا أنها تستخدم في الغالب في الغالب للخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن لأن هذه الخلايا يمكنها مقاومة ساعات من التلاعب16,17. تعد تقنية FACS أداة قوية لفرز الخلايا بناء على علامات الفلورسنت والخصائص الخلوية باستخدام قياس التدفق الخلوي18،19،20. ومع ذلك ، استخدم عدد قليل جدا من الدراسات هذه الطريقة لعزل الخلايا لزراعة الخلايا. هذه التقنية مكلفة وتتطلب موظفين ذوي مهارات عالية لاستخدامها وصيانتها ؛ بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب الحفاظ على خلايا قابلة للحياة ومعقمة في نهاية إجراء الفرز21. بشكل عام ، يبدو أن MACS تقنية بسيطة وغير مكلفة للحصول على ثقافات نقية للغاية وقابلة للحياة من الخلايا العصبية الأولية تحت المهاد. تستخدم الطريقة حبات مغناطيسية مرتبطة بالخلايا عبر جسم مضاد. هذا يسمح بعزل الخلايا باستخدام المجال المغناطيسي للعمود.
نصف هنا طريقة تعتمد على تقنية MACS ، والتي تستخدم عادة مع الخلايا العصبية القشرية. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا العصبية تحت المهاد القابلة للحياة والنقاء للغاية من حيث المبدأ. في هذه الدراسة ، نقوم بإعداد الثقافات الأولية للخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات اللبتين (LepR) ، مثل الخلايا العصبية ARCPOMC و ARCAgRP ، الموجودة فقط في نواة المقوس. تستجيب هذه الخلايا العصبية لليبتين ، وهو هرمون فقدان الشهية الذي تفرزه الأنسجة الدهنية ، بطرق كيميائية حيوية وكهربائية. لذلك ، فإن عزل هذه المجموعة من الخلايا العصبية في الثقافة يسمح بدراسة خصائصها الهرمونية والأيضية والكهربائية في المختبر.
ملاحظة: يتم توضيح منظر عام للإجراء التجريبي بيانيا في الشكل 1 أ. تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت على الفئران في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مؤسستنا (IACUC). استخدمنا فئران C57BL6 / J البالغة من العمر 3 أشهر ، والتي تم إيواؤها في حظيرة معتمدة من جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (AAALAC) ، تحت رعاية طبيب بيطري. عاشت الفئران في أقفاص كبيرة ، مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام ، وتم إطعامها حسب الحاجة.
1. التحقق من الحمل والحمل
2. الوسائط ، لوحة 24 بئر ، وإعداد المواد
3. إعداد الكاشف لتفكك الأنسجة العصبية ، باتباع توجيهات مجموعة التفكك العصبي
4. استخراج الأجنة
5. استخراج ما تحت المهاد وجمعها وتفكك الأنسجة
6. عد الخلايا
7. الاختيار السلبي
ملاحظة: يتيح الانتقاء السلبي للمستخدمين الحصول على مزرعة عصبية أولية نقية عن طريق فصل الخلايا العصبية وغير العصبية. استخدم المحاليل المبردة مسبقا.
8. الفصل المغناطيسي ، الاختيار السلبي
ملاحظة: الفصل المغناطيسي هو خطوة حاسمة تسمح بفصل الخلايا غير العصبية عن الخلايا العصبية. يتم تمرير العينة التي تحتوي على خلايا عصبية وغير عصبية عبر المجال المغناطيسي والخلايا غير العصبية ، المرتبطة بمركب حبة مغناطيسية من البيوتين والأجسام المضادة ، محاصرة في العمود (الشكل 1C). يتم استخلاص الخلايا العصبية الحرة من خلال العمود ويتم جمعها في أنبوب 15 mL.
9. الاختيار الإيجابي
ملاحظة: بمجرد الحصول على تعليق الخلايا العصبية النقية ، يتم إجراء اختيار إيجابي لعزل الخلايا المستهدفة. يمكن عزل الخلايا باستخدام جسم مضاد مقترن بالبيوتين لمولد ضد سطحي. يتم التعرف على الجسم المضاد بواسطة حبات مغناطيسية مضادة للبيوتين. من خلال تدفق تعليق الخلية عبر العمود ، يتم احتجاز الخلايا ذات الأهمية فقط في المجال المغناطيسي.
10. الفصل المغناطيسي ، الاختيار الإيجابي
11. صيانة زراعة الخلايا
12. تلطيخ الخلايا العصبية المناعية
تصف هذه الورقة بروتوكولا لعزل الخلايا العصبية المستهدفة في منطقة ما تحت المهاد (الشكل 1). نطاق الطريقة هو دراسة خصائص عصبية محددة في سياق خاضع للرقابة ومعزول. وهكذا ، تم استخراج أجنة الفئران من السدود الحامل في E14-E16. تمت إزالة السحايا ، وتم عزل منطقة ما تحت المهاد عن بقية الدماغ. تم فصل الأنسجة بلطف مع خليطين من الإنزيمات المحضرة حديثا باستخدام مجموعة التفكك المشار إليها. أولا ، تم فصل الخلايا غير العصبية عن الخلايا العصبية الدبقية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، وتم جمع الخلايا العصبية في نفس تعليق الخلية الواحدة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تصنيف الخلايا غير العصبية باستخدام مزيج من الأجسام المضادة التي تتعرف على حواجز السطح غير العصبية. بعد الحضانة ، تم اقتران مجمع خلايا الأجسام المضادة مع الميكروبيدات المغناطيسية ثم مر لاحقا عبر عمود مغناطيسي لاحتجاز الخلايا غير العصبية.
أسفرت هذه الخطوة عن تعليقين للخلايا ، أحدهما يحتوي على خلايا غير عصبية والآخر يحتوي على خلايا عصبية. يمكن طلاء كلا التعليقين على الفور. بدلا من ذلك ، يمكن التلاعب بتعليق الخلايا العصبية لفصل مجموعة فرعية عصبية (تعليق مستهدف) عن الباقي باستخدام نفس الإستراتيجية. بناء على تجربة الاهتمام ، يمكن طلاء الخلايا العصبية من 125000 إلى 200000 خلية / مم3. يمكن استخدام الثقافات الأقل كثافة لتحليل الخلايا العصبية بدقة خلية واحدة: من التطور المحوري ، والتكوين المشبكي ، والانتقال إلى الفيزيولوجيا الكهربية. يمكن استخدام الثقافات الأكثر كثافة للتحليلات الكيميائية الحيوية ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، واللطخة الغربية ، واللطخة الجنوبية ، واللطخة الشمالية ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، وتسلسل الحمض النووي الريبي.
في هذه الدراسة ، تم استهداف LepR لعزل الخلايا العصبية المشاركة في نظام الميلانوكورتين ، مثل الخلايا العصبية ARCPOMC و ARCAgRP. تم طلاء الخلايا بكثافات تتراوح من 120000 خلية / مم 3 ، للخلايا العصبية LepR + ، إلى 200000 خلية / مم3 لمجموعات الخلايا العصبية العامة. بعد 48 ساعة ، بدأت الخلايا العصبية LepR + في تكوين الخلايا العصبية (الشكل 2). في DIV4 ، أظهرت الامتدادات المحورية تقدما ، بينما بدأت العمليات التغصنية في الظهور. في DIV6 ، تم تطوير الخلايا العصبية بشكل كاف وبالتالي كانت جاهزة للتحليل. أظهرت تجارب التألق المناعي على الخلايا العصبية LepR + تعبيرا بنسبة 99٪ عن LepR (أخضر ، الشكل 3 أ). لم يلاحظ أي خلايا دبقية أو خلايا غير عصبية أخرى ، مما يؤكد نقاء الثقافة العصبية الأولية. تم تأكيد الطبيعة العصبية للخلايا من خلال تلطيخ البروتين 2 المرتبط بالأنابيب الدقيقة (MAP2) ، مع تحديد المحاور العصبية والنتوءات الشجيرية (الشكل 3B). في DIV10 ، عبرت 30٪ من خلايا LepR + عن POMC (أحمر). هذا متوقع لأن غالبية خلايا LepR + تعبر إما عن POMC أو AgRP. يوضح الشكل 3C ، D التوطين المشترك بين إشارات POMC و LepR. لاحظ أن التوطين المشترك كان بارزا عند النواة وحولها ، كما هو متوقع.
تم استخدام الثقافات العامة التي تحتوي على مجموعات عصبية غير متجانسة تحت المهاد للسيطرة. أظهر التألق المناعي اتصالا ووظائف متشابكة ، كما تم تقييمها بواسطة Synapsin-1 (أخضر) و PSD 95 (أحمر) تلطيخ مشترك (الشكل 4 أ ، ب). كان عدد الخلايا العصبية LepR + الموجودة في الثقافة العامة ~ 5٪ ، وهي نسبة تتوافق مع فكرة أن غالبية الخلايا العصبية المعبرة عن LepR قد تم اختيارها أثناء عملية الفصل المغناطيسي (خلايا LepR + التمثيلية موضحة في الشكل 4C ، D). جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها خلال هذه الدراسة متاحة على https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.
الشكل 1: مخطط التدفق التجريبي والإعداد. أ: تمثيل بياني للإجراء التجريبي. الذهاب لا تذهب: ≥106 خلايا ضرورية للمضي قدما في عزل الخلية. رقم الخلية الأمثل هو 107. ب: صورة تمثيلية لدماغ جنين E16 . يشار إلى ما تحت المهاد والسحايا. (ج) إعداد MACS المستخدم لفصل الخلايا المستهدفة وعزلها. يشار إلى الحامل المغناطيسي والفاصل المغناطيسي والعمود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الثقافة العصبية بين DIV2 و DIV6. (أ) تظهر خلايا LepR + التي تم الحصول عليها من الانتقاء الإيجابي انخفاضا في كثافة الخلايا واتصالها ، ولكن التطور الطبيعي للخلايا العصبية (الأسهم الحمراء) والمحاور العصبية (الأسهم الزرقاء) والزوائد الشجيرية (الأسهم الخضراء). تم طلاء الخلايا بكثافة 120000 خلية / مم3. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) الخلايا العصبية تحت المهاد العامة ، المطلية بكثافة 200000 خلية / مم3 ، تظهر ميزات النمو والنمو الطبيعية والاتصال (الأسهم السوداء). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: DIV = أيام في المختبر. LepR = مستقبلات اللبتين. جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها لبناء هذا الرقم متاحة في https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يتم تلخيص الخلايا العصبية في الجسم الحي بواسطة خلايا LepR + العصبية المستزرعة. (أ) صور تمثيلية لثقافة الخلايا العصبية التي تعبر عن LepR (أخضر ؛ DAPI أزرق). تسعة وتسعون في المئة من الخلايا عبرت عن LepR. تم طلاء الخلايا العصبية بكثافة 120000 خلية / مم3 . في DIV7 ، قدمت الخلايا العصبية محاور عصبية ممدودة ، ونضج تغصني ، واتصال عصبي (أسهم). شريط المقياس = 40 ميكرومتر. (ب) استخدم التألق المناعي مع مضاد MAP2 لتأكيد الطبيعة العصبية للخلايا. يتم عرض الأشكال الخاصة بالخلايا العصبية مثل المحاور العصبية والتشعبات والنتوءات (الأسهم). شريط المقياس = 40 ميكرومتر. ج: تكبير خلايا LepR+ . LepR باللون الأخضر و DAPI باللون الأزرق. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (د) التلوين المشترك مع LepR (أخضر) و POMC (أحمر). ما يقرب من 30 ٪ من الخلايا العصبية LepR + كانت مناعية مشتركة ل POMC ، والتي تم اكتشافها على مستوى النواة (الأسهم الحمراء). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; MAP2 = البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 ؛ POMC = بروبيوميلانوكورتين. LepR = مستقبلات اللبتين. جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها لبناء هذا الرقم متاحة في https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلخص الخلايا في الجسم الحي الخلايا العصبية تحت المهاد العامة المستزرعة. (أ) صور تمثيلية لثقافة عصبية عامة تحت المهاد ملطخة ب Synapsin 1 (أخضر) و PSD95 (أحمر) و DAPI (أزرق). أظهرت الخلايا العصبية اتصالا متطورا ووظائف متشابكة (أسهم). شريط المقياس = 40 ميكرومتر. (B) تكبير المربع في (A) ، مع إظهار التوطين المشترك ل Synapsin 1 (أخضر) و PSD95 (أحمر ، أسهم). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ج، د) صور تمثيلية تظهر خلايا LepR + في ثقافة عامة. شكلت خلايا LepR + (الخضراء) ~ 5٪ من الإجمالي. يشار إلى خلايا LepR + التمثيلية بالأسهم. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. (ه، و) تكبير المربعات في (C,D) تظهر مستقبلات اللبتين النقطية الخضراء المترجمة في سوما. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها لبناء هذا الرقم متاحة في https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يعد التحقيق في الخصائص الكيميائية الحيوية والكهربائية للخلايا العصبية تحت المهاد أمرا أساسيا لفهم الأساس الجزيئي لعملية التمثيل الغذائي ، والتنظيم الحراري ، وإدارة الحالة المزاجية ، وسلوك التغذية ، والمزيد. ومع ذلك ، فإن عدم التجانس العصبي في منطقة ما تحت المهاد يجعل هذا الجهد صعبا ، وهناك حاجة إلى طرق لعزل ودراسة مجموعات فرعية محددة تحت المهاد.
تستخدم التقنيات في الجسم الحي CRE-recombinase ، وعلم البصريات ، والقياس الضوئي للألياف ، وتصوير الكالسيوم. تسمح هذه الأساليب في المقام الأول بدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية تحت المهاد ، وهناك عدد قليل جدا من الطرق المتاحة حاليا للتحقيق في سماتها غير الكهربائية. يمكن أن توفر تقنية MACS التي تم تطويرها في هذه الدراسة تقنية قابلة لعزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية تحت المهاد في المختبر ، وبالتالي توفير العلاجات والتحليلات المستهدفة. الثقافات العصبية أسهل في الإدارة مقارنة بالثقافات المشتركة لمجموعات عصبية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تتجنب الثقافات النقية الآثار المربكة الناجمة عن وجود الخلايا الدبقية والخلايا الدبقية الصغيرة. وبالتالي ، يمكن دراسة الخلايا العصبية من نفس المنطقة والنوع تحت المهاد استجابة لمدخلات التمثيل الغذائي والهرمونية المحددة.
في هذا البروتوكول ، اخترنا الخلايا العصبية تحت المهاد التي تعبر عن LepR. تم استزراع خلايا LepR + المعزولة للتحقيق في خصائصها الخلوية والمورفولوجية والجزيئية التي يصعب دراستها في الجسم الحي. كان نقاء الثقافات 99 ٪ ، مما يدعم دقة الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت خلايا LepR + صحية وقابلة للحياة في DIV7 حتى DIV21.
هذه التقنية ، ومع ذلك ، لديها بعض القيود. E18 أو أقدم الثقافات العصبية النقية يصعب الحفاظ عليها. لذلك ، تقتصر نافذة الاستخراج على E14-E16. هذا يعني أن التغييرات الخلوية التي تحدث بعد E16 مفقودة. على سبيل المثال ، يزداد التعبير عن مستقبلات اللبتين في الخلايا العصبية ARC خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة22. يجب إجراء إجراء العزل في أسرع وقت ممكن لتقليل الإجهاد الخلوي والموت وتحسين الغلة. يمكن أن يستغرق الإجراء ما يصل إلى 5 ساعات ؛ وبالتالي ، من الضروري الحفاظ على الظروف المعقمة وتقليل التلاعب إلى الحد الأدنى الضروري. يمكن أن يؤدي الاختيار الإيجابي إلى انخفاض الغلة بسبب انخفاض كميات الأنسجة المتاحة ، مما يحد من عدد التجارب التي يمكن إجراؤها باستخدام إعداد واحد. لوحظ ارتفاع موت الخلايا العصبية ، ربما بسبب انخفاض كثافة الخلايا وانخفاض الاتصال العصبي والدعم داخل الخلايا العصبية.
علاوة على ذلك ، يجب أن يرتبط الجسم المضاد الذي يستهدف المستضد محل الاهتمام بسطح الخلية لضمان الفصل الصحيح ؛ عادة ما تكون الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي مناسبة لتقنية MACS. إذا لم يتم استخدام الجسم المضاد من قبل في طرق فصل الخلايا ، فستكون هناك حاجة إلى تجارب التحقق والمعايرة لتحديد الاستخدام والتركيز المثاليين. يتطلب استخراج الخلايا المستهدفة علامة سطح الخلية. هنا استخدمنا جسما مضادا بيوتينيلاتي ولكن من حيث المبدأ ، يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع جزيئات أخرى ، مثل FITC (فلوريسئين إيزوثيوسيانات) و PE (مضاد فيكويريثرين المنقى). يمكن أيضا تطبيق تقنية MACS على الخلايا العصبية التي تعبر عن الفلوروفور ، مثل GFP أو بروتين Tag آخر ، مما قد يزيد من الخصوصية والعائد. إذا لم يتم استخدام الفلوروفور ، فسيكون البديل هو تأكيد التعبير عن الجزيء محل الاهتمام عن طريق التألق المناعي قبل إجراء تجارب الخلايا الحية. ستختبر الدراسات المستقبلية صحة هذه البدائل.
أحد الجوانب المهمة التي لم تعالجها هذه الدراسة يتعلق ب "إخلاص" المجموعات العصبية الفرعية. تأكدنا من أن الخلايا العصبية LepR + المستزرعة عبرت عن POMC ، وهو توقيع للخلايا العصبية الأصليةARC POMC . ومع ذلك ، سيكون من الضروري إجراء المزيد من الاختبارات لاستنتاج أن الثقافات العصبية LepR + تلخص نظيراتها الأصلية في الجسم الحي . بشكل عام ، قد يوفر بروتوكول عزل الخلايا العصبية MACS المقدم هنا طريقة صالحة وفعالة لدراسة آليات المهاد في المختبر والتي سيكون من الصعب التحقيق فيها في الجسم الحي.
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
تم إنشاء الأشكال الرسومية مع BioRender.com. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIA (R01AG060919) ومنحة NSF (2030348) إلى FS.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Embryo extraction | |||
1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
Bench pads | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Cell Culture | |||
Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
Staining | |||
Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved