A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة خلايا شعيرات القوقعة الأولية من الفئران. في البداية ، تم تشريح عضو كورتي من قوقعة الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام) تحت المجهر. بعد ذلك ، تم هضم الخلايا إنزيميا في تعليق خلية واحدة وتحديدها باستخدام التألق المناعي بعد عدة أيام في الثقافة.

Abstract

خلايا شعر القوقعة هي المستقبلات الحسية للنظام السمعي. تقع هذه الخلايا في عضو كورتي ، العضو الحسي المسؤول عن السمع ، داخل المتاهة العظمية للأذن الداخلية. تتكون خلايا شعيرات القوقعة من نوعين متميزين تشريحيا ووظيفيا: خلايا الشعر الخارجية والداخلية. الأضرار التي لحقت أي منهما يؤدي إلى فقدان السمع. والجدير بالذكر أن خلايا الشعر الداخلية لا يمكن أن تتجدد ، والضرر الذي يلحق بها دائم. ومن ثم، فإن زراعة خلايا الشعر الأولية في المختبر أمر لا غنى عنه للتحقيق في الآثار الوقائية أو التجديدية لخلايا الشعر القوقعي. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر.

بعد الإزالة اليدوية للجدار الجانبي للقوقعة ، تم تشريح الظهارة السمعية بدقة من القوقعة تحت المجهر ، وتم تحضينها في خليط يتكون من 0.25٪ trypsin-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتم تعليقها برفق في وسط الاستزراع باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. تم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح الخلية ، وتم طرد المرشح بالطرد المركزي ، وتم استزراع الخلايا في 24 لوحة بئر. تم تحديد خلايا الشعر بناء على قدرتها على التعبير عن مركب النقل الميكانيكي ، الميوسين-VIIa ، الذي يشارك في التوترات الحركية ، وعن طريق وضع العلامات الانتقائية على F-actin باستخدام phalloidin. وصلت الخلايا إلى التقاء >90٪ بعد 4 د في الثقافة. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للخصائص البيولوجية لخلايا الشعر المستزرعة في المختبر وتوضح كفاءة مزارع خلايا الشعر القوقعة ، مما يضع أساسا منهجيا متينا لمزيد من البحث السمعي.

Introduction

تلعب خلايا شعيرات القوقعة أدوارا مهمة في اكتشاف الصوت ونقل الإشارات إلى العصب السمعي. خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تعمل كمستقبلات حسية أولية وتحول الاهتزازات الصوتية إلى إشارات كهربائية في الفقاريات. تتكون الظهارة الحسية للأذن الداخلية للثدييات من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجية. في مناطق الغشاء الأساسية المختلفة ، تدرك خلايا الشعر الأصوات بترددات مختلفة (بين 20 و 2000 هرتز)1. وظيفة خلايا الشعر الخارجية هي عملية تضخيم ميكانيكية نشطة تساعد على ضبط الأذن الداخلية للثدييات ، مما يمنح حساسية عالية للصوت. خلايا الشعر الداخلية هي المسؤولة عن اكتشاف الأصوات. بعد إزالة الاستقطاب المتدرج ، تنتقل المعلومات الصوتية إل....

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على (رقم 2021-847) من قبل لجنة جامعة شيان جياوتونغ لاستخدام ورعايتها.

1. التعقيم وإعداد المواد

  1. تعقيم أدوات التشريح باستخدام التطهير بالبخار بدرجة حرارة عالية وضغط عال وتجفيفها في حاضنة 50 درجة مئوية طوال الليل.
  2. تحضير 100 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10 ملغ / مل من البنسلين / الستربتومايسين (أضف 10 مل من FBS و 10 ميكرولتر من محلول مخزون البنسلين إلى 90 مل من وسط النسر المعدل (EMEM) من Dulbecco) مسبقا وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. تشريح وإزالة العظم الصدغي لجمع الظهارة السمعية

    ....

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، قمنا بزرع الخلايا المعزولة. اعتبرت بذور خلايا شعر القوقعة الأولية ناجحة إذا لم تطفو الخلايا في وسط الاستزراع وانتشرت في غضون 24 ساعة. حددنا عدد خلايا الشعر بعد التصاقها وانتشارها إلى مجاميع مسطحة في قاع الطبق. بعد 1 يوم ، تم التصاق خلايا الشعر الحية بإحكام في الجزء ال.......

Discussion

بالمقارنة مع خط خلايا HEI-OC1 ، فإن الثقافات الأولية لخلايا الشعر تكرر بدقة أكبر الحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي. لذلك ، يبدو أن طريقة الزراعة الأولية السمعية التي تم إنشاؤها عن طريق عزل الخلايا الحية عن أعضاء القوقعة وزراعتها على الفور هي أداة قيمة لإجراء أبحاث مكثفة حول الأنظمة ال.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NFSC 82101224 إلى YG)

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm BioLite cell culture dishThermo Fisher Scientific130182using for culture
35 mm Nunc cell culture dishThermo Fisher Scientific150318using for culture
6-well palateThermo Fisher Scientific310109005using for culture
70 µm cell strainersBD Company352350using for filter
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientifcA11008immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11965092using for culture
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12483020using for culture
ForcepsDumont5#using for dissection
Leica anatomy microscopeGermanyS9iusing for dissection
Penicillin/streptomycinThermo Fisher Scientific15140-122using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIaAbcam companyab92996immunofluorescent staining
ScissorBelevor10cm/04.0524.10using for dissection
Triton X-100Sigma Aldrich 9036-19-5immunofluorescent staining
TrypsinThermo Fisher Scientific25200072using for culture

References

  1. Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
  2. Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EDTA 24 VIIa F actin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved