Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة خلايا شعيرات القوقعة الأولية من الفئران. في البداية ، تم تشريح عضو كورتي من قوقعة الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام) تحت المجهر. بعد ذلك ، تم هضم الخلايا إنزيميا في تعليق خلية واحدة وتحديدها باستخدام التألق المناعي بعد عدة أيام في الثقافة.

Abstract

خلايا شعر القوقعة هي المستقبلات الحسية للنظام السمعي. تقع هذه الخلايا في عضو كورتي ، العضو الحسي المسؤول عن السمع ، داخل المتاهة العظمية للأذن الداخلية. تتكون خلايا شعيرات القوقعة من نوعين متميزين تشريحيا ووظيفيا: خلايا الشعر الخارجية والداخلية. الأضرار التي لحقت أي منهما يؤدي إلى فقدان السمع. والجدير بالذكر أن خلايا الشعر الداخلية لا يمكن أن تتجدد ، والضرر الذي يلحق بها دائم. ومن ثم، فإن زراعة خلايا الشعر الأولية في المختبر أمر لا غنى عنه للتحقيق في الآثار الوقائية أو التجديدية لخلايا الشعر القوقعي. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر.

بعد الإزالة اليدوية للجدار الجانبي للقوقعة ، تم تشريح الظهارة السمعية بدقة من القوقعة تحت المجهر ، وتم تحضينها في خليط يتكون من 0.25٪ trypsin-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتم تعليقها برفق في وسط الاستزراع باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. تم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح الخلية ، وتم طرد المرشح بالطرد المركزي ، وتم استزراع الخلايا في 24 لوحة بئر. تم تحديد خلايا الشعر بناء على قدرتها على التعبير عن مركب النقل الميكانيكي ، الميوسين-VIIa ، الذي يشارك في التوترات الحركية ، وعن طريق وضع العلامات الانتقائية على F-actin باستخدام phalloidin. وصلت الخلايا إلى التقاء >90٪ بعد 4 د في الثقافة. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للخصائص البيولوجية لخلايا الشعر المستزرعة في المختبر وتوضح كفاءة مزارع خلايا الشعر القوقعة ، مما يضع أساسا منهجيا متينا لمزيد من البحث السمعي.

Introduction

تلعب خلايا شعيرات القوقعة أدوارا مهمة في اكتشاف الصوت ونقل الإشارات إلى العصب السمعي. خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تعمل كمستقبلات حسية أولية وتحول الاهتزازات الصوتية إلى إشارات كهربائية في الفقاريات. تتكون الظهارة الحسية للأذن الداخلية للثدييات من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجية. في مناطق الغشاء الأساسية المختلفة ، تدرك خلايا الشعر الأصوات بترددات مختلفة (بين 20 و 2000 هرتز)1. وظيفة خلايا الشعر الخارجية هي عملية تضخيم ميكانيكية نشطة تساعد على ضبط الأذن الداخلية للثدييات ، مما يمنح حساسية عالية للصوت. خلايا الشعر الداخلية هي المسؤولة عن اكتشاف الأصوات. بعد إزالة الاستقطاب المتدرج ، تنتقل المعلومات الصوتية إلى الدماغ من خلال الألياف العصبية السمعية2.

قد يحدث فقدان السمع بسبب العيوب الوراثية أو الشيخوخة أو صدمة الضوضاء أو الاستخدام المفرط للأدوية السامة للأذن ، والتي تشكل مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم 3,4. ينتج فقدان السمع بشكل رئيسي عن تلف لا رجعة فيه لخلايا الشعر5. فيما يتعلق بفقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، على الرغم من توصل الباحثين إلى توافق في الآراء حول العديد من تفاصيل مسبباته ، إلا أنه لا يوجد فهم شامل للعديد من الآليات الأساسية. خلايا الشعر الخارجية معرضة بشكل خاص للتعرض المفرط السمعي6. تشارك خلايا شعر القوقعة الحساسة ميكانيكيا في فقدان السمع المرتبط بالعمر. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تنكس خلايا الشعر لا تزال غير معروفة. تؤدي العديد من التغييرات في العمليات الجزيئية إلى شيخوخة خلايا الشعر ، والإجهاد التأكسدي ، واستجابة تلف الحمض النووي ، والالتهام الذاتي ، وعدم تنظيم التعبير عن الجينات المتعلقة بتخصص خلايا الشعرونسخها 7.

نظرا لأن الأذن الداخلية مغلفة بالعظم الصدغي ، في عمق أصعب عظام الجسم ، فلا يمكن الوصول إليها تجريبيا ، مما يشكل تحديا للتحقيقات في آليات إصلاح خلايا الشعر وتجديدها. ومن ثم ، أصبح إنشاء مزارع في المختبر للتحقيق في وظيفة خلايا الشعر طريقة مثالية للبحث في آليات التجديد والإصابة في الأذن الداخلية. تم وصف إجراءات تحضير مزارع النمط العضوي للقوقعة في الدراسات السابقة8،9،10. استخدم الباحثون في جميع أنحاء العالم تقنيات مختلفة لتشريح القوقعة الصناعية وإعداد السطح. على الرغم من التحديات المستمرة ، تم إنشاء العديد من أنظمة زراعة خلايا الشعر الأولية بنجاح في المختبر. تحتوي مزارع أعضاء القوقعة الصناعية على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك خلايا الشعر، وخلايا ديتر، وخلايا هينسن، وخلايا الأعمدة، والألياف العصبية السمعية. إن الفهم المتعمق للتغيرات في خلايا الشعر على المستويين الخلوي والجزيئي بعد الإصابة سيمكن من تطوير أدوات بحث أكثر قوة. هدفت هذه الدراسة إلى توضيح خطوات عزل أعضاء القوقعة من الفئران الوليدية وفصل خلايا الشعر الوفيرة إنزيميا للدراسات في المختبر. تم تأكيد طبيعة الخلايا المستزرعة باستخدام تلطيخ المناعي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على (رقم 2021-847) من قبل لجنة جامعة شيان جياوتونغ لاستخدام ورعايتها.

1. التعقيم وإعداد المواد

  1. تعقيم أدوات التشريح باستخدام التطهير بالبخار بدرجة حرارة عالية وضغط عال وتجفيفها في حاضنة 50 درجة مئوية طوال الليل.
  2. تحضير 100 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10 ملغ / مل من البنسلين / الستربتومايسين (أضف 10 مل من FBS و 10 ميكرولتر من محلول مخزون البنسلين إلى 90 مل من وسط النسر المعدل (EMEM) من Dulbecco) مسبقا وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. تشريح وإزالة العظم الصدغي لجمع الظهارة السمعية

  1. القتل الرحيم لما مجموعه 10 فئران حديثي الولادة (تتراوح أعمارهم بين P3 و P5) عن طريق قطع الرأس على الجليد. استخدم منهجية بديلة معتمدة أخلاقيا ، إذا لزم الأمر.
  2. ثبت الرأس في مكانه ، وافتح فروة الرأس على طول الخيط السهمي باستخدام مقص التشغيل الدقيق ، وافصل فروة الرأس وثبتها بشكل ثنائي بالأصابع ، كما هو موضح في الشكل 1 أ.
  3. قم بإزالة الدماغ باستخدام مصعد صغير السمحاق وقسم الجمجمة القاعدية. قطع الجمجمة بالمقص والوجه للأمام لفتح الجمجمة. استخدم طرف المقص لكشط الدماغ وفضح قاعدة الجمجمة.
  4. راقب العظام الصدغية الثنائية في قاعدة الجمجمة (الشكل 1C). استخدم المقص لقطع قاعدة الجمجمة على طول خط الوسط ، وكشط الجلد ، وإزالة أي عظم غير ضروري (الشكل 1D ، D ').
  5. احتفظ بالعظام الصدغية وانقلها إلى أطباق بتري معقمة مقاس 35 مم تحتوي على محلول ملح هانك المتوازن الطازج (HBSS) (الشكل 1E).
  6. استخدم ملقطين #5 مدببين لإزالة الفقاعة والأنسجة المحيطة بها من الجزء الصخري من العظم الصدغي (الشكل 1E).
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، لن تكون المتاهة العظمية في العظم الصدغي للفئران متكلسة تماما ويمكن تشريحها بسهولة باستخدام الملقط.
  7. أمسك الملقط بيد واحدة لإصلاح الجزء نصف الدائري من العظم الصدغي وألصق القدم السفلية للملقط في مكان النافذة المستديرة باليد الأخرى لفصل العظم الجانبي للقوقعة عن دهليز سكالا. قم بإزالة الجزء الصخري من العظم الصدغي بعناية دون لمس ظهارة OC. بعد ذلك ، افصل بعناية وأزل المتاهة العظمية للقوقعة من النهاية القاعدية إلى النهاية القمية (الشكل 1F).
  8. قم بعزل عضو ظهارة كورتي الحسية بعناية من modiolus باستخدام ملقط # 5 مدبب (الشكل 1G).
  9. أمسك الرباط الحلزوني ، وافصله بعناية عن الأوعية الدموية السطورية باستخدام ملقط التشغيل الجزئي ، وانقل الظهارة السمعية النظيفة إلى طبق ثقافة معقم 3 مم يحتوي على HBSS باستخدام ماصة 200 ميكرولتر (الشكل 1H).
  10. اجمع 20 عينة من كل وانقلها بسرعة إلى طبق بتري معقم 100 مم يحتوي على HBSS لخطوة التحضير التالية (الشكل 1).

3. التصنيف الأنزيمي للحصول على خلايا الشعر السمعية

  1. نقل ظهارة السمع إلى 10 مل من DMEM الطازجة التي تحتوي على 0.25٪ التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
  2. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، افصل خلايا الشعر برفق عن الصفيحة القاعدية والخلايا الأخرى تحت مجهر التشغيل.
  3. أضف 10 مل أخرى من وسط الاستزراع لمنع التصنيف.
  4. قم بتصفية الخلايا العالقة في وسط الاستزراع من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وجمع المرشح في أنبوب نظيف سعة 50 مل ، وطرده مركزيا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. أعد تعليق خلايا الشعر في 5 مل على الأقل من وسط المزرعة عن طريق سحبها برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر. تجنب إدخال الفقاعات.
  6. ضع غطاء في الجزء السفلي من لوحة ستة آبار مقدما. عد الخلايا واستزراعها بكثافة 106 خلايا / مل في ألواح من ستة آبار.
  7. تنمو الخلايا الملتصقة في 2 مل من DMEM (تحتوي على 10٪ من FBS ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير وسط الثقافة كل يوم.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن استخدام هذا البروتوكول لا يؤدي إلى الحصول على خلايا الشعر النقية. بناء على طريقة زراعة الخلايا الأولية هذه ، نوصي باستخدام خلايا d2 أو d3 لمزيد من الدراسات ، حيث قد تشكل خلايا الشعر حوالي 70٪ من الخلايا في المزرعة وتكون في حالة جيدة.

4. تلطيخ المناعي

  1. حصاد الخلايا المستزرعة من d1 إلى d6 (بئر واحد في اليوم). نضح وسط الثقافة وشطف الخلايا 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. قم بإزالة الخلايا المثبتة وشطف لمدة 3 × 3 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.
  4. تتخلل الخلايا مع PBS التي تحتوي على 0.2٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في RT.
  5. احتضان الخلايا المتداخلة بمحلول مانع يتكون من 10٪ FBS في PBS لمدة 20 دقيقة في RT.
  6. قم بتلطيخ الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للميوسين (مخفف عند 1: 200 في PBS) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  7. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS المعقم واحتضانها بجسم مضاد ثانوي (Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للأرانب MYO7A ، المخفف 1: 500 في PBS) والفولويدين المسمى بالفلوريسئين (Alexa Fluor 488 ، لتحديد بنية الخلية) لمدة 2 ساعة في RT.
  8. شطف الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الثانوية.
  9. أضف 1-2 قطرات من وسيط التركيب باستخدام DAPI على الشرائح ، وقم بتركيب قسائم الغطاء ، وضعها تحت مجهر المسح بالليزر متحد البؤر لالتقاط صور للخلايا.

5. التحليل الإحصائي

  1. قم بإجراء تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) متبوعا باختبارات Tukey اللاحقة لتحليل التغيرات في القيم الرمادية للميوسين-VIIa و phalloidin بمرور الوقت. استخدم طريقة تعليم الحروف لتمييز الفروق الإحصائية.
  2. قم بإجراء ANOVAs إضافية أحادية الاتجاه متبوعة باختبارات Tukey اللاحقة لمقارنة نسبة الخلايا الإيجابية للفالويدين بين عينات الخلايا من اليوم 1 إلى اليوم 6 ونسبة الخلايا الإيجابية للميوسين السابع في نفس الأيام.

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، قمنا بزرع الخلايا المعزولة. اعتبرت بذور خلايا شعر القوقعة الأولية ناجحة إذا لم تطفو الخلايا في وسط الاستزراع وانتشرت في غضون 24 ساعة. حددنا عدد خلايا الشعر بعد التصاقها وانتشارها إلى مجاميع مسطحة في قاع الطبق. بعد 1 يوم ، تم التصاق خلايا الشعر الحية بإحكام في الجزء ال...

Discussion

بالمقارنة مع خط خلايا HEI-OC1 ، فإن الثقافات الأولية لخلايا الشعر تكرر بدقة أكبر الحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي. لذلك ، يبدو أن طريقة الزراعة الأولية السمعية التي تم إنشاؤها عن طريق عزل الخلايا الحية عن أعضاء القوقعة وزراعتها على الفور هي أداة قيمة لإجراء أبحاث مكثفة حول الأنظمة ال...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NFSC 82101224 إلى YG)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm BioLite cell culture dishThermo Fisher Scientific130182using for culture
35 mm Nunc cell culture dishThermo Fisher Scientific150318using for culture
6-well palateThermo Fisher Scientific310109005using for culture
70 µm cell strainersBD Company352350using for filter
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientifcA11008immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11965092using for culture
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12483020using for culture
ForcepsDumont5#using for dissection
Leica anatomy microscopeGermanyS9iusing for dissection
Penicillin/streptomycinThermo Fisher Scientific15140-122using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIaAbcam companyab92996immunofluorescent staining
ScissorBelevor10cm/04.0524.10using for dissection
Triton X-100Sigma Aldrich 9036-19-5immunofluorescent staining
TrypsinThermo Fisher Scientific25200072using for culture

References

  1. Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
  2. Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
  3. Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
  4. Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
  5. Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
  6. Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
  7. Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
  8. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
  9. Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
  10. Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
  11. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
  12. Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
  13. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
  14. Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
  15. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
  16. Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
  17. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  18. Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
  19. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EDTA 24 VIIa F actin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved