Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.

Zusammenfassung

Cochlea-Haarzellen sind die sensorischen Rezeptoren des Hörsystems. Diese Zellen befinden sich im Corti-Organ, dem Sinnesorgan, das für das Hören zuständig ist, im knöchernen Labyrinth des Innenohrs. Cochlea-Haarzellen bestehen aus zwei anatomisch und funktionell unterschiedlichen Typen: äußeren und inneren Haarzellen. Eine Schädigung eines der beiden führt zu Hörverlust. Vor allem, da sich die inneren Haarzellen nicht regenerieren können und die Schäden an ihnen dauerhaft sind. Daher ist die In-vitro-Kultivierung von primären Haarzellen unabdingbar, um die schützende oder regenerative Wirkung von Cochlea-Haarzellen zu untersuchen. Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Haarzellen von Mäusen zu finden.

Nach manueller Entfernung der Cochlea-Seitenwand wurde das Hörepithel unter einem Mikroskop sorgfältig aus dem Cochlea-Modiolus präpariert, 10 Minuten lang bei 37 °C in einer Mischung aus 0,25 % Trypsin-EDTA inkubiert und mit einer 200-μl-Pipettenspitze vorsichtig in einem Nährmedium suspendiert. Die Zellsuspension wurde durch einen Zellfilter geleitet, das Filtrat wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in 24-Well-Platten kultiviert. Die Haarzellen wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit identifiziert, einen Mechanotransduktionskomplex, Myosin-VIIa, zu exprimieren, der an motorischen Spannungen beteiligt ist, und durch selektive Markierung von F-Aktin unter Verwendung von Phalloidin. Die Zellen erreichten nach 4 Tagen in Kultur eine Konfluenz von >90 %. Diese Methode kann unser Verständnis der biologischen Eigenschaften von in vitro kultivierten Haarzellen verbessern und die Effizienz von Cochlea-Haarzellkulturen demonstrieren, wodurch eine solide methodische Grundlage für die weitere auditive Forschung geschaffen wird.

Einleitung

Cochlea-Haarzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Schallerkennung und Signalübertragung an den Hörnerv. Haarzellen sind mechanistische Zellen, die als primäre Sinnesrezeptoren fungieren und Schallschwingungen in Wirbeltieren in elektrische Signale umwandeln. Das sensorische Epithel des Innenohrs von Säugetieren besteht aus einer einzigen Reihe innerer Haarzellen und drei Reihen äußerer Haarzellen. In verschiedenen basischen Membranbereichen nehmen Haarzellen Töne mit unterschiedlichen Frequenzen (zwischen 20 und 2.000 Hz⁾ wahr1. Die Funktion der äußeren Haarzellen ist ein aktiver mechanischer Verstärkungsprozess, der bei der Feinabstimmung des Innenohrs von Säugetieren hilft und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Geräuschen verleiht. Innere Haarzellen sind für die Erkennung von Geräuschen zuständig. Nach der abgestuften Depolarisation werden akustische Informationen über die Hörnervenfasern an das Gehirn weitergeleitet².

Hörverlust kann durch genetische Defekte, Alterung, Lärmtraumata oder den übermäßigen Gebrauch von ototoxischen Medikamenten verursacht werden, die weltweit ein großes Gesundheitsproblem darstellen ^3,4. Hörverlust resultiert hauptsächlich aus irreversiblen Schäden an Haarzellen⁵. In Bezug auf lärminduzierten Hörverlust haben sich die Forscher zwar über mehrere Details ihrer Ätiologie geeinigt, aber es fehlt ein umfassendes Verständnis der zahlreichen zugrunde liegenden Mechanismen. Äußere Haarzellen sind besonders anfällig für akustische Überbelichtung⁶. Mechanosensitive Cochlea-Haarzellen sind an altersbedingtem Hörverlust beteiligt. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die der Degeneration von Haarzellen zugrunde liegen, sind jedoch noch unbekannt. Mehrere Veränderungen in den molekularen Prozessen führen zu Haarzellalterung, oxidativem Stress, DNA-Schadensreaktion, Autophagie und Dysregulation der Expression und Transkription von Genen, die mit der Spezialisierung von Haarzellen zusammenhängen⁷.

Da das Innenohr vom Schläfenbein tief im härtesten Knochen des Körpers umhüllt ist, ist es experimentell nicht zugänglich, was eine Herausforderung für die Erforschung der Mechanismen der Reparatur und Regeneration von Haarzellen darstellt. Die Etablierung von In-vitro-Kulturen zur Untersuchung der Funktion von Haarzellen ist daher zu einer idealen Methode geworden, um die Regenerations- und Verletzungsmechanismen des Innenohrs zu erforschen. Die Verfahren zur Herstellung von organotypischen Cochlea-Kulturen wurden in früheren Studien^beschrieben 8,9,10. Forscher auf der ganzen Welt haben verschiedene Techniken der Cochlea-Mikrodissektion und Oberflächenpräparation eingesetzt. Trotz der anhaltenden Herausforderungen konnten verschiedene primäre Haarzellkultursysteme erfolgreich in vitro etabliert werden. Cochlea-Organkulturen enthalten verschiedene Zelltypen, darunter Haarzellen, Deiters-Zellen, Hensen-Zellen, Säulenzellen und Hörnervenfasern. Ein tiefgreifendes Verständnis der Veränderungen in Haarzellen auf zellulärer und molekularer Ebene nach einer Verletzung wird die Entwicklung leistungsfähigerer Forschungswerkzeuge ermöglichen. Ziel dieser Studie war es, die Schritte zur Isolierung von Cochlea-Organen von neugeborenen Mäusen und zur enzymatischen Ablösung der reichlich vorhandenen Haarzellen für In-vitro-Studien zu demonstrieren. Die Beschaffenheit der kultivierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals genehmigt (Nr. 2021-847).

1. Sterilisation und Materialvorbereitung

1. Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge mittels Hochtemperatur- und Hochdruck-Dampfdesinfektion und trocknen Sie sie über Nacht in einem 50 °C warmen Inkubator.
2. 100 ml des Nährmediums mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (10 ml FBS und 10 μl Penicillin-Stammlösung zu 90 ml Modified Eagle Medium (EMEM) von Dulbecco geben) im Voraus zubereiten und bei 4 °C lagern.

2. Dissektion und Entfernung des Schläfenbeins zur Entnahme von Hörepithelien

1. Euthanasie einer Gesamtzahl von 10 neugeborenen Mäusen (im Alter zwischen P3 und P5) durch Enthauptung auf Eis. Verwenden Sie bei Bedarf eine alternative, ethisch anerkannte Methodik.
2. Halten Sie den Kopf an Ort und Stelle, öffnen Sie die Kopfhaut entlang der sagittalen Naht mit einer Mikro-Operationsschere und trennen und fixieren Sie die Kopfhaut beidseitig mit den Fingern, wie in Abbildung 1A gezeigt.
3. Entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Periostlift und halbieren Sie den Basalschädel. Schneiden Sie den Schädel mit einer Schere ab und drehen Sie ihn nach vorne, um den Schädel zu öffnen. Benutze die Spitze der Schere, um das Gehirn abzukratzen und die Schädelbasis freizulegen.
4. Beobachten Sie die bilateralen Schläfenknochen an der Schädelbasis (Abbildung 1C). Schneiden Sie mit einer Schere die Schädelbasis entlang der Mittellinie ab, kratzen Sie die Haut ab und entfernen Sie unnötigen Knochen (Abbildung 1D,D').
5. Die Schläfenknochen werden aufbewahrt und in sterile 35-mm-Petrischalen mit frischer Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) überführt (Abbildung 1E).
6. Verwenden Sie zwei #5-Pinzetten, um die Bulla und das umgebende Gewebe aus dem petrosen Teil des Schläfenbeins zu entfernen (Abbildung 1E).
   HINWEIS: In diesem Stadium wäre das knöcherne Labyrinth im Schläfenbein der Mäuse nicht vollständig verkalkt und würde leicht mit einer Pinzette präpariert werden können.
7. Halten Sie die Pinzette mit einer Hand fest, um den halbkreisförmigen Teil des Schläfenbeins zu fixieren, und stecken Sie mit der anderen Hand den unteren Fuß der Pinzette in die runde Fensternische, um den lateralen Knochen der Cochlea vom Scala-Vestibulum zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig den petrosen Teil des Schläfenbeins, ohne das OC-Epithel zu berühren. Anschließend wird das knöcherne Labyrinth der Cochlea vorsichtig vom basalen Ende bis zum apikalen Ende abgetrennt und entfernt (Abbildung 1F).
8. Das Organ des sensorischen Corti-Epithels wird vorsichtig mit einer #5-Pinzette vom Modiolus isoliert (Abbildung 1G).
9. Halten Sie das Spiralband fest, trennen Sie es vorsichtig mit einer mikrooperativen Pinzette von der Stria vascularis und übertragen Sie das saubere Hörepithel mit einer 200-μl-Pipette in eine 3 mm große sterile Kulturschale mit HBSS (Abbildung 1H).
10. Entnehmen Sie 20 Proben von jedem Tier und überführen Sie sie schnell in eine sterile 100 mm Petrischale mit HBSS für den nächsten Präparationsschritt (Abbildung 1).

3. Enzymatische Disaggregation zur Gewinnung von Hörhaarzellen

1. Das Hörepithel wird in 10 ml frisches DMEM mit 0,25 % Trypsin überführt und 12 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
2. Mit einer 200-μl-Pipettenspitze die Haarzellen unter einem Operationsmikroskop vorsichtig von der Basallamina und anderen Zellen trennen.
3. Fügen Sie weitere 10 ml Nährmedium hinzu, um die Disaggregation zu hemmen.
4. Die suspendierten Zellen im Nährmedium werden durch einen 70-μm-Filter filtriert, das Filtrat in einem sauberen 50-ml-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert.
5. Resuspendieren Sie die Haarzellen in mindestens 5 ml Nährmedium, indem Sie sie mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze vorsichtig auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen.
6. Legen Sie im Voraus ein Deckglas auf den Boden einer Sechs-Well-Platte. Zählen Sie die Zellen und kultivieren Sie sie mit einer Dichte von 10^{bis 6} Zellen/ml in Sechs-Well-Platten.
7. Die adhärenten Zellen werden in 2 ml DMEM (mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) bei 37 °C und 5 % CO₂ gezüchtet. Wechseln Sie täglich das Nährmedium.
   HINWEIS: Es sollte erwähnt werden, dass die Verwendung dieses Protokolls nicht dazu führt, dass reine Haarzellen gewonnen werden. Basierend auf dieser primären Zellkulturmethode empfehlen wir die Verwendung von d2- oder d3-Zellen für weitere Studien, da Haarzellen etwa 70 % der Zellen in Kultur ausmachen und sich in einem guten Zustand befinden können.

4. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Entnehmen Sie die kultivierten Zellen von d1 bis d6 (eine Vertiefung pro Tag). Saugen Sie das Nährmedium ab und spülen Sie die Zellen 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
3. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie die Zellen 3 x 3 min lang mit PBS.
4. Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS mit 0,2% Triton X-100 für 10 min bei RT.
5. Inkubieren Sie die permeabilisierten Zellen mit einer Blockierungslösung, die aus 10% FBS in PBS besteht, für 20 min bei RT.
6. Färben Sie die Zellen mit monoklonalen Anti-Myosin-Antikörpern (verdünnt auf 1:200 in PBS) bei 4 °C über Nacht.
7. Waschen Sie die Zellen 3x mit sterilem PBS und inkubieren Sie sie mit sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit MYO7A, verdünnt 1:500 in PBS) und Fluorescein-markiertem Phalloidin (Alexa Fluor 488, zur Identifizierung der Zellstruktur) für 2 h bei RT.
8. Spülen Sie die Zellen 3x mit PBS, um die Sekundärantikörper zu entfernen.
9. Geben Sie 1-2 Tropfen Eindeckmedium mit DAPI auf die Objektträger, montieren Sie die Deckgläser und legen Sie sie unter ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um Fotos von den Zellen aufzunehmen.

5. Statistische Analyse

1. Führen Sie eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durch, gefolgt von Tukey-Post-hoc-Tests, um die Veränderungen der Grauwerte von Myosin-VIIa und Phalloidin im Laufe der Zeit zu analysieren. Verwenden Sie die Buchstabenmarkierungsmethode, um statistische Unterschiede zu markieren.
2. Führen Sie zusätzliche Einweg-ANOVAs durch, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Tests, um das Phalloidin-positive Zellverhältnis zwischen Zellproben von Tag 1 bis Tag 6 und das Myosin-VII-positive Zellverhältnis an denselben Tagen zu vergleichen.

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll haben wir die isolierten Zellen ausgesät. Primäre Cochlea-Haarzellsamen galten als erfolgreich, wenn die Zellen nicht im Nährmedium schwammen und sich innerhalb von 24 Stunden ausbreiteten. Wir bestimmten die Anzahl der Haarzellen, nachdem sie am Boden der Schale anhafteten und sich in flachen Aggregaten ausbreiteten. Nach 1 Tag wurden lebende Haarzellen fest an den Boden der Kulturschale geklebt und nicht anhaftende Zellen wurden durch Spülen mit PBS entfernt. Typischerweise verdoppelte sich di...

Diskussion

Im Vergleich zur HEI-OC1-Zelllinie bildeten Primärkulturen von Haarzellen den physiologischen Zustand der Zellen in vivo genauer nach. Daher scheint die auditive Primärkulturmethode, bei der lebende Zellen aus Cochlea-Organen isoliert und sofort kultiviert werden, ein wertvolles Werkzeug für umfangreiche Forschungen am auditorischen System zu sein. Bestimmte Techniken sind entscheidend für eine erfolgreiche Kultur. Erstens erhöht die Minimierung der Dauer der Trennung des Corti-Organs vom Schläfenbein die Wahrschei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture