Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.

Zusammenfassung

Cochlea-Haarzellen sind die sensorischen Rezeptoren des Hörsystems. Diese Zellen befinden sich im Corti-Organ, dem Sinnesorgan, das für das Hören zuständig ist, im knöchernen Labyrinth des Innenohrs. Cochlea-Haarzellen bestehen aus zwei anatomisch und funktionell unterschiedlichen Typen: äußeren und inneren Haarzellen. Eine Schädigung eines der beiden führt zu Hörverlust. Vor allem, da sich die inneren Haarzellen nicht regenerieren können und die Schäden an ihnen dauerhaft sind. Daher ist die In-vitro-Kultivierung von primären Haarzellen unabdingbar, um die schützende oder regenerative Wirkung von Cochlea-Haarzellen zu untersuchen. Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Haarzellen von Mäusen zu finden.

Nach manueller Entfernung der Cochlea-Seitenwand wurde das Hörepithel unter einem Mikroskop sorgfältig aus dem Cochlea-Modiolus präpariert, 10 Minuten lang bei 37 °C in einer Mischung aus 0,25 % Trypsin-EDTA inkubiert und mit einer 200-μl-Pipettenspitze vorsichtig in einem Nährmedium suspendiert. Die Zellsuspension wurde durch einen Zellfilter geleitet, das Filtrat wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in 24-Well-Platten kultiviert. Die Haarzellen wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit identifiziert, einen Mechanotransduktionskomplex, Myosin-VIIa, zu exprimieren, der an motorischen Spannungen beteiligt ist, und durch selektive Markierung von F-Aktin unter Verwendung von Phalloidin. Die Zellen erreichten nach 4 Tagen in Kultur eine Konfluenz von >90 %. Diese Methode kann unser Verständnis der biologischen Eigenschaften von in vitro kultivierten Haarzellen verbessern und die Effizienz von Cochlea-Haarzellkulturen demonstrieren, wodurch eine solide methodische Grundlage für die weitere auditive Forschung geschaffen wird.

Einleitung

Cochlea-Haarzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Schallerkennung und Signalübertragung an den Hörnerv. Haarzellen sind mechanistische Zellen, die als primäre Sinnesrezeptoren fungieren und Schallschwingungen in Wirbeltieren in elektrische Signale umwandeln. Das sensorische Epithel des Innenohrs von Säugetieren besteht aus einer einzigen Reihe innerer Haarzellen und drei Reihen äußerer Haarzellen. In verschiedenen basischen Membranbereichen nehmen Haarzellen Töne mit unterschiedlichen Frequenzen (zwischen 20 und 2.000 Hz⁾ wahr1. Die Funktion der äußeren Haarzellen ist ein aktiver mechanischer Verstärkungsprozess, der bei der Feinabstimmung....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals genehmigt (Nr. 2021-847).

1. Sterilisation und Materialvorbereitung

1. Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge mittels Hochtemperatur- und Hochdruck-Dampfdesinfektion und trocknen Sie sie über Nacht in einem 50 °C warmen Inkubator.
2. 100 ml des Nährmediums mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (10 ml FBS und 10 μl Penicillin-Stammlösung zu 90 ml Modified Eagle Medium (EMEM) von Dulbecco geben) im Voraus zubereiten und bei 4 °C lagern.

2. Dis....

Diskussion

Im Vergleich zur HEI-OC1-Zelllinie bildeten Primärkulturen von Haarzellen den physiologischen Zustand der Zellen in vivo genauer nach. Daher scheint die auditive Primärkulturmethode, bei der lebende Zellen aus Cochlea-Organen isoliert und sofort kultiviert werden, ein wertvolles Werkzeug für umfangreiche Forschungen am auditorischen System zu sein. Bestimmte Techniken sind entscheidend für eine erfolgreiche Kultur. Erstens erhöht die Minimierung der Dauer der Trennung des Corti-Organs vom Schläfenbein die Wahrschei.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture