Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

Riepilogo

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.

Abstract

Le cellule ciliate cocleari sono i recettori sensoriali del sistema uditivo. Queste cellule si trovano nell'organo di Corti, l'organo sensoriale responsabile dell'udito, all'interno del labirinto osseo dell'orecchio interno. Le cellule ciliate cocleari sono costituite da due tipi anatomicamente e funzionalmente distinti: cellule ciliate esterne e interne. Il danno a uno di essi provoca la perdita dell'udito. In particolare, poiché le cellule ciliate interne non possono rigenerarsi e il loro danno è permanente. Pertanto, la coltivazione in vitro di cellule ciliate primarie è indispensabile per studiare gli effetti protettivi o rigenerativi delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo.

Dopo la rimozione manuale della parete laterale cocleare, l'epitelio uditivo è stato meticolosamente sezionato dal miolo cocleare al microscopio, incubato in una miscela composta da tripsina-EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C e delicatamente sospeso nel terreno di coltura utilizzando un puntale per pipette da 200 μL. La sospensione cellulare è stata fatta passare attraverso un filtro cellulare, il filtrato è stato centrifugato e le cellule sono state coltivate in piastre a 24 pozzetti. Le cellule ciliate sono state identificate in base alla loro capacità di esprimere un complesso di meccanotrasduzione, la miosina-VIIa, che è coinvolta nelle tensioni motorie, e tramite marcatura selettiva della F-actina utilizzando falloidina. Le cellule hanno raggiunto l'>90% di confluenza dopo 4 giorni in coltura. Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle caratteristiche biologiche delle cellule ciliate coltivate in vitro e dimostrare l'efficienza delle colture di cellule ciliate cocleari, stabilendo una solida base metodologica per ulteriori ricerche uditive.

Introduzione

Le cellule ciliate cocleari svolgono un ruolo importante nel rilevamento del suono e nella trasmissione del segnale al nervo uditivo. Le cellule ciliate sono cellule meccanicistiche che funzionano come recettori sensoriali primari e convertono le vibrazioni sonore in segnali elettrici nei vertebrati. L'epitelio sensoriale dell'orecchio interno dei mammiferi comprende una singola fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne. In diverse aree di base della membrana, le cellule ciliate percepiscono i suoni a frequenze diverse (tra 20 e 2.000 Hz)¹. La funzione delle cellule ciliate esterne è un processo di amplificazione mec....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati (n. 2021-847) dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Xi'an Jiaotong.

1. Sterilizzazione e preparazione del materiale

1. Sterilizzare gli strumenti di dissezione utilizzando la disinfezione a vapore ad alta temperatura e ad alta pressione e asciugarli in un'incubatrice a 50 °C per una notte.
2. Preparare in anticipo 100 mL di terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 10 mg/mL di penicillina/streptomicina (aggiungere 10 mL di FBS e 10 μL di soluzione madre di penicillina a 90 mL di terreno di Dulbecco Mo....

Discussione

Rispetto alla linea cellulare HEI-OC1, le colture primarie di cellule ciliate hanno replicato in modo più accurato lo stato fisiologico delle cellule in vivo. Pertanto, il metodo di coltura primaria uditiva stabilito isolando cellule viventi dagli organi cocleari e coltivandole immediatamente sembra essere uno strumento prezioso per una ricerca approfondita sui sistemi uditivi. Alcune tecniche sono fondamentali per una cultura di successo. In primo luogo, ridurre al minimo la durata della separazione dell'organo di Cort.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture