Isolement et culture de cellules ciliées cochléaires primaires de souris néonatales

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des cellules ciliées cochléaires primaires de souris. Initialement, l’organe de Corti a été disséqué à partir de cochlées murines néonatales (âgées de 3 à 5 jours) au microscope. Par la suite, les cellules ont été digérées enzymatiquement dans une suspension unicellulaire et identifiées par immunofluorescence après plusieurs jours de culture.

Résumé

Les cellules ciliées cochléaires sont les récepteurs sensoriels du système auditif. Ces cellules sont situées dans l’organe de Corti, l’organe sensoriel responsable de l’audition, dans le labyrinthe osseux de l’oreille interne. Les cellules ciliées cochléaires se composent de deux types anatomiquement et fonctionnellement distincts : les cellules ciliées externes et internes. Les dommages causés à l’un ou l’autre d’entre eux entraînent une perte auditive. Notamment, car les cellules ciliées internes ne peuvent pas se régénérer et les dommages qui leur sont causés sont permanents. Par conséquent, la culture in vitro de cellules ciliées primaires est indispensable pour étudier les effets protecteurs ou régénérateurs des cellules ciliées cochléaires. Cette étude visait à découvrir une méthode d’isolement et de culture des cellules ciliées de souris.

Après l’ablation manuelle de la paroi latérale cochléaire, l’épithélium auditif a été méticuleusement disséqué du modiolus cochléaire au microscope, incubé dans un mélange composé de 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 10 min à 37 °C, et délicatement suspendu dans un milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. La suspension cellulaire a été passée à travers un filtre cellulaire, le filtrat a été centrifugé et les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits. Les cellules ciliées ont été identifiées en fonction de leur capacité à exprimer un complexe de mécanotransduction, la myosine-VIIa, qui est impliquée dans les tensions motrices, et par marquage sélectif de la F-actine à l’aide de la phalloïdine. Les cellules ont atteint >90% de confluence après 4 jours de culture. Cette méthode peut améliorer notre compréhension des caractéristiques biologiques des cellules ciliées cultivées in vitro et démontrer l’efficacité des cultures de cellules ciliées cochléaires, établissant ainsi une base méthodologique solide pour la recherche auditive ultérieure.

Introduction

Les cellules ciliées cochléaires jouent un rôle important dans la détection des sons et la transmission du signal au nerf auditif. Les cellules ciliées sont des cellules mécanistes qui fonctionnent comme des récepteurs sensoriels primaires et convertissent les vibrations sonores en signaux électriques chez les vertébrés. L’épithélium sensoriel de l’oreille interne des mammifères comprend une seule rangée de cellules ciliées internes et trois rangées de cellules ciliées externes. Dans différentes zones membranaires de base, les cellules ciliées perçoivent des sons à différentes fréquences (entre 20 et 2 000 Hz)¹. La fonction des cellules ciliées externes est un processus d’amplification mécanique actif qui aide à affiner l’oreille interne des mammifères, conférant une grande sensibilité au son. Les cellules ciliées internes sont responsables de la détection des sons. Après une dépolarisation graduée, l’information acoustique est transmise au cerveau par les fibres nerveuses auditives².

La perte auditive peut être causée par des défauts génétiques, le vieillissement, les traumatismes sonores ou l’utilisation excessive de médicaments ototoxiques, qui constituent un problème de santé majeur dans le monde entier ^3,4. La perte auditive résulte principalement de dommages irréversibles aux cellules ciliées⁵. En ce qui concerne la perte auditive induite par le bruit, bien que les chercheurs soient parvenus à un consensus sur plusieurs détails de son étiologie, une compréhension globale des nombreux mécanismes sous-jacents fait défaut. Les cellules ciliées externes sont particulièrement vulnérables à la surexposition acoustique⁶. Les cellules ciliées cochléaires mécanosensibles sont impliquées dans la perte auditive liée à l’âge ; Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la dégénérescence des cellules ciliées restent inconnus. Plusieurs changements dans les processus moléculaires conduisent au vieillissement des cellules ciliées, au stress oxydatif, à la réponse aux dommages de l’ADN, à l’autophagie et à la dérégulation de l’expression et de la transcription des gènes liés à la spécialisation des cellules ciliées⁷.

Comme l’oreille interne est enfermée dans l’os temporal, profondément dans l’os le plus dur du corps, elle est expérimentalement inaccessible, ce qui pose un défi aux recherches sur les mécanismes de réparation et de régénération des cellules ciliées. Par conséquent, l’établissement de cultures in vitro pour étudier la fonction des cellules ciliées est devenu une méthode idéale pour la recherche sur les mécanismes de régénération et de lésion de l’oreille interne. Les procédures de préparation des cultures organotypiques cochléaires ont été décrites dans des études antérieures ^8,9,10. Les chercheurs du monde entier ont utilisé diverses techniques de microdissection cochléaire et de préparation de surface. Malgré les défis persistants, divers systèmes de culture de cellules ciliées primaires ont été établis avec succès in vitro. Les cultures d’organes cochléaires contiennent divers types de cellules, notamment des cellules ciliées, des cellules de Deiters, des cellules de Hensen, des cellules piliers et des fibres nerveuses auditives. Une compréhension approfondie des changements dans les cellules ciliées aux niveaux cellulaire et moléculaire après une blessure permettra de développer des outils de recherche plus puissants. Cette étude visait à démontrer les étapes permettant d’isoler les organes cochléaires de souris néonatales et de détacher enzymatiquement les cellules ciliées abondantes pour des études in vitro. La nature des cellules cultivées a été confirmée par coloration par immunofluorescence.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées (n° 2021-847) par le Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université Jiaotong de Xi’an.

1. Stérilisation et préparation du matériel

1. Stérilisez les outils de dissection à l’aide d’une désinfection à la vapeur à haute température et à haute pression et séchez-les dans un incubateur à 50 °C pendant la nuit.
2. Préparer à l’avance 100 mL du milieu de culture contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 mg/mL de pénicilline/streptomycine (ajouter 10 mL de FBS et 10 μL de solution mère de pénicilline à 90 mL de milieu Eagle modifié (EMEM) de Dulbecco) et conserver à 4 °C.

2. Dissection et ablation de l’os temporal pour le prélèvement d’épithéliums auditifs

1. Euthanasier un nombre total de 10 souris nouveau-nées (âgées entre P3 et P5) par décapitation sur glace. Utiliser une autre méthodologie approuvée par l’éthique, si nécessaire.
2. Maintenez la tête en place, ouvrez le cuir chevelu le long de la suture sagittale à l’aide de ciseaux micro-opératoires, et séparez et fixez le cuir chevelu bilatéralement avec les doigts, comme indiqué à la figure 1A.
3. Retirez le cerveau à l’aide d’un petit élévateur périosté et coupez le crâne basal en deux. Coupez le crâne avec des ciseaux et retournez-le vers l’avant pour ouvrir le crâne ; Utilisez la pointe des ciseaux pour gratter le cerveau et exposer la base du crâne.
4. Observez les os temporaux bilatéraux à la base du crâne (Figure 1C). À l’aide de ciseaux, coupez la base du crâne le long de la ligne médiane, grattez la peau et retirez tout os inutile (Figure 1D,D').
5. Conserver et transférer les os temporaux dans des boîtes de Pétri stériles de 35 mm contenant une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) fraîche (Figure 1E).
6. Utilisez deux pinces à pointes #5 pour retirer la bulle et les tissus environnants de la partie pétreuse de l’os temporal (Figure 1E).
   REMARQUE : À ce stade, le labyrinthe osseux dans l’os temporal des souris ne serait pas complètement calcifié et serait facilement disséqué à l’aide de pinces.
7. Tenez la pince d’une main pour fixer la partie semi-circulaire de l’os temporal et collez le pied inférieur de la pince dans la niche ronde de la fenêtre avec l’autre main pour séparer l’os latéral de la cochlée du vestibule de la sscale. Retirez délicatement la partie pétreuse de l’os temporal sans toucher l’épithélium OC. Par la suite, séparez et retirez soigneusement le labyrinthe osseux de la cochlée de l’extrémité basale à l’extrémité apicale (Figure 1F).
8. Micro-isoler soigneusement l’organe de l’épithélium sensoriel Corti du modiolus à l’aide d’une pince à pointes #5 (Figure 1G).
9. Tenir le ligament spiralé, le séparer soigneusement de la strie vasculaire à l’aide d’une pince microopératoire et transférer l’épithélium auditif propre dans une boîte de culture stérile de 3 mm contenant du HBSS à l’aide d’une pipette de 200 μL (Figure 1H).
10. Prélever 20 échantillons de chaque animal et les transférer rapidement dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm contenant de l’HBSS pour l’étape de préparation suivante (figure 1).

3. Désagrégation enzymatique pour l’obtention de cellules ciliées auditives

1. Transférer l’épithélium auditif dans 10 mL de DMEM frais contenant 0,25 % de trypsine et incuber à 37 °C pendant 12 min.
2. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, séparez délicatement les cellules ciliées de la lame basale et des autres cellules sous un microscope opératoire.
3. Ajouter 10 mL de milieu de culture pour inhiber la désagrégation.
4. Filtrer les cellules en suspension dans le milieu de culture à travers un filtre de 70 μm, recueillir le filtrat dans un tube propre de 50 ml et le centrifuger à 300 × g pendant 5 min.
5. Remettre les cellules ciliées en suspension dans au moins 5 mL de milieu de culture en les pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’un embout de pipette de 1 000 μL. Évitez d’introduire des bulles.
6. Placez une lamelle au fond d’une plaque à six puits à l’avance. Comptez les cellules et cultivez-les à une densité de 10 à 6 cellules/mL dans des plaques^à six puits.
7. Cultiver les cellules adhérentes dans 2 mL de DMEM (contenant 10 % de FBS, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C et 5 % de CO₂. Changez le milieu de culture tous les jours.
   REMARQUE : Il convient de mentionner que l’utilisation de ce protocole n’entraîne pas l’obtention de cellules ciliées pures. Sur la base de cette méthode de culture cellulaire primaire, nous recommandons d’utiliser des cellules d2 ou d3 pour d’autres études, car les cellules ciliées peuvent constituer environ 70 % des cellules en culture et être en bon état.

4. Coloration immunofluorescente

1. Prélever les cellules cultivées de j1 à j6 (un puits par jour). Aspirer le milieu de culture et rincer les cellules 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante (RT).
3. Retirez le fixateur et rincez les cellules pendant 3 x 3 min avec du PBS.
4. Perméabiliser les cellules avec du PBS contenant 0,2 % de Triton X-100 pendant 10 min à RT.
5. Incuber les cellules perméabilisées avec une solution bloquante composée de 10 % de FBS dans du PBS pendant 20 min à RT.
6. Colorer les cellules avec un anticorps monoclonal anti-myosine (dilué à 1 :200 dans du PBS) à 4 °C pendant la nuit.
7. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS stérile et incubez-les avec un anticorps secondaire (Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin MYO7A, dilué 1 :500 dans du PBS) et de la phalloïdine marquée à la fluorescéine (Alexa Fluor 488, pour identifier la structure cellulaire) pendant 2 h à RT.
8. Rincez les cellules 3 fois avec du PBS pour éliminer les anticorps secondaires.
9. Ajoutez 1 à 2 gouttes de support de montage avec DAPI sur les lames, montez les lamelles et placez-les sous un microscope confocal à balayage laser pour capturer des photos des cellules.

5. Analyse statistique

1. Effectuer une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) suivie de tests post-hoc de Tukey pour analyser les changements dans les valeurs grises de la myosine-VIIa et de la phalloïdine au fil du temps. Utilisez la méthode de marquage des lettres pour marquer les différences statistiques.
2. Effectuer d’autres ANOVA à un facteur suivies des tests post-hoc de Tukey pour comparer le rapport cellulaire positif à la phalloïdine entre les échantillons cellulaires du jour 1 au jour 6 et le rapport cellulaire myosine-VII positif les mêmes jours.

Résultats

En suivant ce protocole, nous avons ensemencé les cellules isolées. Les graines primaires de cellules ciliées cochléaires ont été considérées comme réussies si les cellules ne flottaient pas dans le milieu de culture et ne se propageaient pas dans les 24 heures. Nous avons déterminé le nombre de cellules ciliées après qu’elles aient adhéré et se soient répandues en agrégats plats au fond de la boîte. Après 1 jour, les cellules ciliées vivantes ont été étroitement collées au fond de la boîte de ...

Discussion

Par rapport à la lignée cellulaire HEI-OC1, les cultures primaires de cellules ciliées ont reproduit plus précisément l’état physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, la méthode de culture primaire auditive établie en isolant des cellules vivantes des organes cochléaires et en les cultivant immédiatement semble être un outil précieux pour des recherches approfondies sur les systèmes auditifs. Certaines techniques sont cruciales pour une culture réussie. Tout d’abord, la minimisation de la dur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture