Выделение и культивирование первичных волосковых клеток улитки у новорожденных мышей

Резюме

В данной статье мы представляем подробный протокол выделения и культивирования первичных волосковых клеток улитки у мышей. Первоначально орган корти препарировали из неонатальных (в возрасте 3-5 дней) мышиных улиток под микроскопом. Впоследствии клетки ферментативно переваривали в одноклеточную суспензию и идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции через несколько дней в культуре.

Аннотация

Волосковые клетки улитки являются сенсорными рецепторами слуховой системы. Эти клетки расположены в кортиевом органе, органе чувств, отвечающем за слух, в костном лабиринте внутреннего уха. Кохлеарные волосковые клетки состоят из двух анатомически и функционально различных типов: наружных и внутренних волосковых клеток. Повреждение любого из них приводит к потере слуха. Примечательно, что внутренние волосковые клетки не могут регенерировать, и их повреждение является необратимым. Следовательно, культивирование первичных волосковых клеток in vitro необходимо для изучения защитных или регенеративных эффектов волосковых клеток улитки. Это исследование было направлено на поиск метода выделения и культивирования волосковых клеток мышей.

После ручного удаления боковой стенки улитки слуховой эпителий тщательно отделяли от кохлеарного модиолы под микроскопом, инкубировали в смеси, состоящей из 0,25% трипсина-ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °С и осторожно суспендировали в питательной среде с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр, фильтрат центрифугировали, а клетки культивировали в 24-луночных планшетах. Волосковые клетки были идентифицированы на основе их способности экспрессировать механотрансдукционный комплекс, миозин-VIIa, который участвует в двигательном напряжении, а также путем селективного мечения F-актина с помощью фаллоидина. Клетки достигали >90% слияния через 4 дня в культуре. Этот метод может улучшить наше понимание биологических характеристик культивируемых волосковых клеток in vitro и продемонстрировать эффективность культур кохлеарных волосковых клеток, создавая прочную методологическую основу для дальнейших слуховых исследований.

Введение

Волосковые клетки улитки играют важную роль в обнаружении звука и передаче сигнала к слуховому нерву. Волосковые клетки — это механистические клетки, которые функционируют как первичные сенсорные рецепторы и преобразуют звуковые колебания в электрические сигналы у позвоночных. Сенсорный эпителий внутреннего уха млекопитающих состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов наружных волосковых клеток. В разных основных участках мембраны волосковые клетки воспринимают звуки на разных частотах (от 20 до 2000 Гц)¹. Функция наружных волосковых клеток заключается в активном механическом процессе усиления, который помогает тонко настроить внутреннее ухо млекопитающих, обеспечивая высокую чувствительность к звуку. Внутренние волосковые клетки отвечают за распознавание звуков. После ступенчатой деполяризации акустическая информация передается в мозг через слуховые нервные волокна².

Потеря слуха может быть вызвана генетическими дефектами, старением, шумовой травмой или чрезмерным использованием ототоксических препаратов, которые представляют собой серьезную проблему для здоровья во всем мире ^3,4. Потеря слуха в основном возникает в результате необратимого повреждения волосковых клеток⁵. Что касается потери слуха, вызванной шумом, то, несмотря на то, что исследователи достигли консенсуса по некоторым деталям ее этиологии, отсутствует всестороннее понимание многочисленных механизмов, лежащих в ее основе. Наружные волосковые клетки особенно уязвимы к акустическому передержанию⁶. Механочувствительные волосковые клетки улитки участвуют в возрастной тугоухости; Однако молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе дегенерации волосковых клеток, остаются неизвестными. Некоторые изменения в молекулярных процессах приводят к старению волосяных клеток, окислительному стрессу, реакции на повреждение ДНК, аутофагии и дисрегуляции экспрессии и транскрипции генов, связанных со специализацией волосяных клеток⁷.

Поскольку внутреннее ухо заключено в височную кость, глубоко в самой твердой кости тела, оно экспериментально недоступно, что создает проблему для исследований механизмов восстановления и регенерации волосковых клеток. Таким образом, создание культур in vitro для изучения функции волосковых клеток стало идеальным методом для исследования механизмов регенерации и повреждения внутреннего уха. Процедуры приготовления кохлеарных органотипических культур были описаны в более ранних работах ^8,9,10. Исследователи по всему миру используют различные методы кохлеарной микродиссекции и подготовки поверхности. Несмотря на сохраняющиеся проблемы, различные системы первичных культивирования волосяных клеток были успешно созданы in vitro. Культуры кохлеарных органов содержат различные типы клеток, включая волосковые клетки, клетки Дейтера, клетки Хенсена, столбчатые клетки и волокна слухового нерва. Глубокое понимание изменений в волосковых клетках на клеточном и молекулярном уровнях после травмы позволит разработать более мощные исследовательские инструменты. Это исследование было направлено на демонстрацию шагов по изоляции кохлеарных органов от новорожденных мышей и ферментативному отделению обильных волосковых клеток для исследований in vitro. Природу культивируемых клеток подтверждали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены (No 2021-847) Комитетом по использованию животных и уходу за животными Сианьского университета Цзяотун.

1. Стерилизация и подготовка материала

1. Стерилизуйте инструменты для препарирования с помощью паровой дезинфекции при высокой температуре и высоком давлении и высушите их в инкубаторе при температуре 50 °C в течение ночи.
2. Заранее приготовьте 100 мл питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10 мг/мл пенициллина/стрептомицина (добавьте 10 мл FBS и 10 мкл исходного раствора пенициллина к 90 мл модифицированной орлиной среды (EMEM)) Dulbecco и храните при 4 °C.

2. Рассечение и удаление височной кости для забора слухового эпителия

1. Усыпить в общей сложности 10 новорожденных мышей (в возрасте от P3 до P5) путем обезглавливания на льду. При необходимости используйте альтернативную, этически одобренную методологию.
2. Удерживая голову на месте, раскройте кожу головы по сагиттальному шву с помощью микроножниц, а затем отделите и зафиксируйте кожу головы с обеих сторон пальцами, как показано на рисунке 1А.
3. Удалите мозг с помощью небольшого надкостничного лифта и разделите пополам базальный череп. Разрежьте череп ножницами и переверните вперед, чтобы открыть череп; Кончиком ножниц соскребите мозг и обнажите основание черепа.
4. Обратите внимание на двусторонние височные кости у основания черепа (рис. 1С). С помощью ножниц разрежьте основание черепа по средней линии, соскребите кожу и удалите все ненужные кости (рис. 1D, D').
5. Сохраните и перенесите височные кости в стерильные чашки Петри диаметром 35 мм, содержащие свежий сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) (Рисунок 1E).
6. Используйте два щипца #5, чтобы удалить буллу и окружающие ткани из каменистой части височной кости (Рисунок 1E).
   Примечание: На этой стадии костный лабиринт в височной кости мышей не будет полностью кальцинирован и будет легко рассечен с помощью щипцов.
7. Одной рукой придерживают щипцы, чтобы зафиксировать полукруглую часть височной кости, а другой рукой воткнуть нижнюю ножку щипцов в круглую оконную нишу, чтобы отделить латеральную кость улитки от преддверия. Осторожно удалите каменистую часть височной кости, не касаясь эпителия ОК. Затем осторожно отделяют и удаляют костный лабиринт улитки от базального конца до апикального конца (рис. 1F).
8. Тщательно микроизолируют орган сенсорного эпителия Корти от модиолуса с помощью щипцов #5 (рис. 1G).
9. Удерживают спиральную связку, осторожно отделяют ее от сосудистых стрий с помощью микрооперационных щипцов и переносят чистый слуховой эпителий в 3-миллиметровую стерильную культуральную чашку, содержащую HBSS, с помощью пипетки на 200 мкл (рис. 1H).
10. Соберите 20 образцов у каждого животного и быстро перенесите их в стерильную чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую HBSS, для следующего этапа подготовки (рис. 1).

3. Ферментативная дезагрегация для получения слуховых волосковых клеток

1. Переносят слуховой эпителий в 10 мл свежего ДМЭМ, содержащего 0,25% трипсина, и инкубируют при 37 °С в течение 12 мин.
2. С помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл аккуратно отделите волосковые клетки от базальной пластинки и другие клетки под операционным микроскопом.
3. Добавьте еще 10 мл питательной среды, чтобы ингибировать дезагрегацию.
4. Взвешенные клетки в питательной среде фильтруют через фильтр 70 мкм, собирают фильтрат в чистую пробирку объемом 50 мл и центрифугируют при 300 × г в течение 5 мин.
5. Ресуспендируйте волосковые клетки не менее чем в 5 мл питательной среды, осторожно пипетируя их вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1000 мкл. Избегайте появления пузырей.
6. Заранее положите покровный стебель на дно шестилуночной тарелки. Подсчитайте клетки и культивируйте их при плотности 10⁶ клеток/мл в шестилуночных планшетах.
7. Выращивают адгезивные клетки в 2 мл DMEM (содержащего 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 °C и 5% CO₂. Меняйте питательную среду каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что использование этого протокола не приводит к получению чистых волосковых клеток. Основываясь на этом методе первичного культивирования клеток, мы рекомендуем использовать клетки d2 или d3 для дальнейших исследований, так как волосковые клетки могут составлять примерно 70% клеток в культуре и быть в хорошем состоянии.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Заготавливают культивируемые клетки от d1 до d6 (по одной лунке в день). Аспирируйте питательную среду и промойте клетки 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS).
2. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
3. Снимите фиксатор и промойте ячейки в течение 3 x 3 мин с помощью PBS.
4. Пермеабилизацию клеток PBS, содержащей 0,2% Triton X-100, в течение 10 мин при RT.
5. Инкубируют пермеабилизированные клетки с блокирующим раствором, состоящим из 10% FBS, в PBS в течение 20 мин при RT.
6. Окрасьте клетки моноклональным антителом против миозина (разведенным в соотношении 1:200 в PBS) при 4 °C в течение ночи.
7. Промывают клетки 3 раза стерильным PBS и инкубируют их со вторичными антителами (Alexa Fluor 594 козий антикроличий MYO7A, разбавленный 1:500 в PBS) и флуоресцеин-меченным фаллоидином (Alexa Fluor 488, для определения клеточной структуры) в течение 2 ч при RT.
8. Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить вторичные антитела.
9. Добавьте 1-2 капли монтажной среды с DAPI на предметные стекла, закрепите покровные стекла и поместите их под лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения фотографий клеток.

5. Статистический анализ

1. Выполните двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом Тьюки post hoc для анализа изменений серых значений миозина-VIIa и фаллоидина с течением времени. Используйте метод буквенной маркировки для обозначения статистических различий.
2. Выполните дополнительные односторонние тесты ANOVA с последующим тестированием по методу Тьюки, чтобы сравнить соотношение фаллоидин-положительных клеток между образцами клеток с 1-го по 6-й день и соотношение миозин-VII-положительных клеток в те же дни.

Результаты

Следуя этому протоколу, мы засеяли изолированные клетки. Первичные семена волосковых клеток улитки считались успешными, если клетки не плавали в питательной среде и распространялись в течение 24 ч. Мы определили количество волосковых клеток после того, как они прилипли и распределилис?...

Обсуждение

По сравнению с клеточной линией HEI-OC1 первичные культуры волосковых клеток более точно воспроизводили физиологическое состояние клеток in vivo. Таким образом, метод первичного культивирования слуховых клеток, основанный на выделении живых клеток из органов улитки и их немедленном культи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture