Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Resumen

Las células ciliadas cocleares son los receptores sensoriales del sistema auditivo. Estas células se encuentran en el órgano de Corti, el órgano sensorial responsable de la audición, dentro del laberinto óseo del oído interno. Las células ciliadas cocleares consisten en dos tipos anatómica y funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. El daño a cualquiera de ellos resulta en pérdida de audición. En particular, como las células ciliadas internas no pueden regenerarse y el daño a ellas es permanente. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células ciliadas primarias es indispensable para investigar los efectos protectores o regenerativos de las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.

Tras la extracción manual de la pared lateral coclear, el epitelio auditivo se diseccionó meticulosamente del modiolo coclear al microscopio, se incubó en una mezcla compuesta por tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 min a 37 °C y se suspendió suavemente en medio de cultivo con una punta de pipeta de 200 μL. La suspensión celular se pasó a través de un filtro celular, el filtrado se centrifugó y las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células ciliadas se identificaron en función de su capacidad para expresar un complejo de mecanotransducción, la miosina-VIIa, que está implicada en las tensiones motoras, y mediante el marcaje selectivo de la F-actina mediante faloidina. Las células alcanzaron >90% de confluencia después de 4 d en cultivo. Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vitro y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.

Introducción

Las células ciliadas cocleares desempeñan un papel importante en la detección del sonido y la transmisión de señales al nervio auditivo. Las células ciliadas son células mecanicistas que funcionan como receptores sensoriales primarios y convierten las vibraciones sonoras en señales eléctricas en los vertebrados. El epitelio sensorial del oído interno de los mamíferos comprende una sola fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas. En diferentes áreas básicas de membrana, las células ciliadas perciben sonidos a diferentes frecuencias (entre 20 y 2.000 Hz)¹. La función de las células ciliadas externas es un proceso ....

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (No. 2021-847) por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong.

1. Esterilización y preparación del material

1. Esterilice las herramientas de disección mediante desinfección con vapor a alta temperatura y alta presión y séquelas en una incubadora a 50 °C durante la noche.
2. Preparar 100 ml del medio de cultivo que contenga un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina (añadir 10 ml de FBS y 10 μl de solución madre de penicilina a 90 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (EMEM)) con antelación y c....

Discusión

En comparación con la línea celular HEI-OC1, los cultivos primarios de células ciliadas replicaron con mayor precisión el estado fisiológico de las células in vivo. Por lo tanto, el método de cultivo primario auditivo establecido mediante el aislamiento de células vivas de los órganos cocleares y su cultivo inmediato parece ser una herramienta valiosa para la investigación exhaustiva de los sistemas auditivos. Ciertas técnicas son cruciales para una cultura exitosa. En primer lugar, minimizar la duración de l.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture