Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Resumen

Las células ciliadas cocleares son los receptores sensoriales del sistema auditivo. Estas células se encuentran en el órgano de Corti, el órgano sensorial responsable de la audición, dentro del laberinto óseo del oído interno. Las células ciliadas cocleares consisten en dos tipos anatómica y funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. El daño a cualquiera de ellos resulta en pérdida de audición. En particular, como las células ciliadas internas no pueden regenerarse y el daño a ellas es permanente. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células ciliadas primarias es indispensable para investigar los efectos protectores o regenerativos de las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.

Tras la extracción manual de la pared lateral coclear, el epitelio auditivo se diseccionó meticulosamente del modiolo coclear al microscopio, se incubó en una mezcla compuesta por tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 min a 37 °C y se suspendió suavemente en medio de cultivo con una punta de pipeta de 200 μL. La suspensión celular se pasó a través de un filtro celular, el filtrado se centrifugó y las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células ciliadas se identificaron en función de su capacidad para expresar un complejo de mecanotransducción, la miosina-VIIa, que está implicada en las tensiones motoras, y mediante el marcaje selectivo de la F-actina mediante faloidina. Las células alcanzaron >90% de confluencia después de 4 d en cultivo. Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vitro y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.

Introducción

Las células ciliadas cocleares desempeñan un papel importante en la detección del sonido y la transmisión de señales al nervio auditivo. Las células ciliadas son células mecanicistas que funcionan como receptores sensoriales primarios y convierten las vibraciones sonoras en señales eléctricas en los vertebrados. El epitelio sensorial del oído interno de los mamíferos comprende una sola fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas. En diferentes áreas básicas de membrana, las células ciliadas perciben sonidos a diferentes frecuencias (entre 20 y 2.000 Hz)¹. La función de las células ciliadas externas es un proceso de amplificación mecánica activa que ayuda a afinar el oído interno de los mamíferos, confiriendo una alta sensibilidad al sonido. Las células ciliadas internas son responsables de detectar los sonidos. Después de la despolarización graduada, la información acústica se transmite al cerebro a^{través de las} fibras nerviosas auditivas.

La pérdida de audición puede ser causada por defectos genéticos, envejecimiento, traumatismos por ruido o el uso excesivo de medicamentos ototóxicos, que constituyen un importante problema de salud en todo el mundo ^3,4. La pérdida de audición se debe principalmente a un daño irreversible en las células ciliadas⁵. Con respecto a la pérdida de audición inducida por ruido, aunque los investigadores han llegado a un consenso sobre varios detalles de su etiología, se carece de una comprensión completa de los numerosos mecanismos subyacentes. Las células ciliadas externas son particularmente vulnerables a la sobreexposición acústica⁶. Las células ciliadas cocleares mecanosensibles están implicadas en la pérdida de audición relacionada con la edad; Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la degeneración de las células ciliadas siguen siendo desconocidos. Varios cambios en los procesos moleculares conducen al envejecimiento de las células ciliadas, al estrés oxidativo, a la respuesta al daño del ADN, a la autofagia y a la desregulación de la expresión y transcripción de genes relacionados con la especialización de las células ciliadas^.

Como el oído interno está encerrado en el hueso temporal, en lo profundo del hueso más duro del cuerpo, es experimentalmente inaccesible, lo que supone un reto para las investigaciones sobre los mecanismos de reparación y regeneración de las células ciliadas. Por lo tanto, el establecimiento de cultivos in vitro para investigar la función de las células ciliadas se ha convertido en un método ideal para la investigación de los mecanismos de regeneración y lesión del oído interno. Los procedimientos para la preparación de cultivos organotípicos cocleares han sido descritos en estudios previos 8,9,10. Investigadores de todo el mundo han empleado diversas técnicas de microdisección coclear y preparación de superficies. A pesar de los desafíos persistentes, se han establecido con éxito varios sistemas de cultivo primario de células ciliadas in vitro. Los cultivos de órganos cocleares contienen varios tipos de células, incluidas las células ciliadas, las células de Deiters, las células de Hensen, las células pilares y las fibras del nervio auditivo. Una comprensión profunda de los cambios en las células ciliadas a nivel celular y molecular después de una lesión permitirá el desarrollo de herramientas de investigación más poderosas. Este estudio tuvo como objetivo demostrar los pasos para aislar órganos cocleares de ratones neonatos y separar enzimáticamente las células ciliadas abundantes para estudios in vitro. La naturaleza de las células cultivadas se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (No. 2021-847) por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong.

1. Esterilización y preparación del material

1. Esterilice las herramientas de disección mediante desinfección con vapor a alta temperatura y alta presión y séquelas en una incubadora a 50 °C durante la noche.
2. Preparar 100 ml del medio de cultivo que contenga un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina (añadir 10 ml de FBS y 10 μl de solución madre de penicilina a 90 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (EMEM)) con antelación y conservar a 4 °C.

2. Disección y extirpación del hueso temporal para la recogida de epitelios auditivos

1. Sacrificar un total de 10 ratones recién nacidos (con edades comprendidas entre P3 y P5) mediante decapitación en hielo. Utilice una metodología alternativa, éticamente aprobada, si es necesario.
2. Mantenga la cabeza en su lugar, abra el cuero cabelludo a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras microquirúrgicas y separe y fije el cuero cabelludo bilateralmente con los dedos, como se muestra en la Figura 1A.
3. Extirpar el cerebro con un pequeño elevador perióstico y dividir en dos la parte basal del cráneo. Corta el cráneo con unas tijeras y voltea hacia adelante para abrir el cráneo; Usa la punta de las tijeras para raspar el cerebro y exponer la base del cráneo.
4. Observar los huesos temporales bilaterales en la base del cráneo (Figura 1C). Use tijeras para cortar la base del cráneo a lo largo de la línea media, raspe la piel y elimine cualquier hueso innecesario (Figura 1D, D').
5. Retenga y transfiera los huesos temporales a placas de Petri estériles de 35 mm que contengan solución salina balanceada de Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).
6. Use dos pinzas de punta #5 para extraer la bulla y el tejido circundante de la porción petrosa del hueso temporal (Figura 1E).
   NOTA: En esta etapa, el laberinto óseo en el hueso temporal de los ratones no estaría completamente calcificado y se diseccionaría fácilmente con fórceps.
7. Sostenga las pinzas con una mano para fijar la parte semicircular del hueso temporal y coloque la parte inferior del pie de las pinzas en el nicho redondo de la ventana con la otra mano para separar el hueso lateral de la cóclea del vestíbulo de la escala. Retire con cuidado la porción petrosa del hueso temporal sin tocar el epitelio OC. Posteriormente, separe y retire cuidadosamente el laberinto óseo de la cóclea desde el extremo basal hasta el extremo apical (Figura 1F).
8. Microaísle cuidadosamente el órgano del epitelio sensorial de Corti del modiolo con pinzas de #5 puntas (Figura 1G).
9. Sujete el ligamento espiral, sepárelo cuidadosamente de la estría vascular con pinzas microquirúrgicas y transfiera el epitelio auditivo limpio a una placa de cultivo estéril de 3 mm que contenga HBSS utilizando una pipeta de 200 μL (Figura 1H).
10. Recoja 20 muestras de cada animal y transfiéralas rápidamente a una placa de Petri estéril de 100 mm que contenga HBSS para el siguiente paso de preparación (Figura 1).

3. Desagregación enzimática para la obtención de células ciliadas auditivas

1. Transfiera el epitelio auditivo a 10 ml de DMEM fresco que contenga tripsina al 0,25% e incube a 37 °C durante 12 min.
2. Con una punta de pipeta de 200 μL, separe suavemente las células ciliadas de la lámina basal y otras células bajo un microscopio quirúrgico.
3. Añadir otros 10 mL de medio de cultivo para inhibir la disgregación.
4. Filtrar las células suspendidas en el medio de cultivo a través de un filtro de 70 μm, recoger el filtrado en un tubo limpio de 50 ml y centrifugarlo a 300 × g durante 5 min.
5. Vuelva a suspender las células ciliadas en al menos 5 ml de medio de cultivo pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1.000 μl. Evite introducir burbujas.
6. Coloque un cubreobjetos en el fondo de una placa de seis pocillos con anticipación. Cuente las células y cultívelas a una densidad de 10^{a 6} células/ml en placas de seis pocillos.
7. Cultivar las células adherentes en 2 mL de DMEM (que contiene 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C y 5% de CO₂. Cambia el medio de cultivo todos los días.
   NOTA: Cabe mencionar que el uso de este protocolo no da como resultado la obtención de células ciliadas puras. Basándonos en este método de cultivo celular primario, recomendamos utilizar células d2 o d3 para estudios posteriores, ya que las células ciliadas pueden constituir aproximadamente el 70% de las células en cultivo y estar en buen estado.

4. Tinción inmunofluorescente

1. Coseche las células cultivadas de d1 a d6 (un pocillo por día). Aspire el medio de cultivo y enjuague las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
3. Retire el fijador y enjuague las celdas durante 3 x 3 minutos con PBS.
4. Permeabilizar las células con PBS que contenga Triton X-100 al 0,2% durante 10 min en RT.
5. Incubar las células permeabilizadas con una solución de bloqueo que consiste en 10% de FBS en PBS durante 20 min a RT.
6. Tiñir las células con un anticuerpo monoclonal anti-miosina (diluido a 1:200 en PBS) a 4 °C durante la noche.
7. Lavar las células 3 veces con PBS estéril e incubarlas con anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo MYO7A, diluido 1:500 en PBS) y faloidina marcada con fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar la estructura celular) durante 2 h en RT.
8. Enjuague las células 3 veces con PBS para eliminar los anticuerpos secundarios.
9. Agregue 1-2 gotas de medio de montaje con DAPI en los portaobjetos, monte los cubreobjetos y colóquelos debajo de un microscopio confocal de barrido láser para capturar fotos de las células.

5. Análisis estadístico

1. Realizar un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) seguido de las pruebas post hoc de Tukey para analizar los cambios en los valores de gris de miosina-VIIa y faloidina a lo largo del tiempo. Utilice el método de marcado de letras para marcar las diferencias estadísticas.
2. Realice ANOVAs unidireccionales adicionales seguidas de las pruebas post-hoc de Tukey para comparar la proporción de células positivas para faloidina entre muestras celulares del día 1 al día 6 y la proporción de células positivas para miosina VII en los mismos días.

Resultados

Siguiendo este protocolo, sembramos las células aisladas. Las semillas de células ciliadas cocleares primarias se consideraron exitosas si las células no flotaban en el medio de cultivo y se diseminaban dentro de las 24 h. Determinamos el número de células ciliadas después de que se adhirieron y se extendieron en agregados planos en el fondo del plato. Después de 1 día, las células ciliadas vivas se adhirieron firmemente al fondo de la placa de cultivo y las células no adherentes se eliminaron enjuagando con PB...

Discusión

En comparación con la línea celular HEI-OC1, los cultivos primarios de células ciliadas replicaron con mayor precisión el estado fisiológico de las células in vivo. Por lo tanto, el método de cultivo primario auditivo establecido mediante el aislamiento de células vivas de los órganos cocleares y su cultivo inmediato parece ser una herramienta valiosa para la investigación exhaustiva de los sistemas auditivos. Ciertas técnicas son cruciales para una cultura exitosa. En primer lugar, minimizar la duración de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture