Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Özet

Koklear tüy hücreleri, işitsel sistemin duyusal reseptörleridir. Bu hücreler, iç kulağın kemik labirenti içinde, işitmeden sorumlu duyu organı olan Corti'nin organında bulunur. Koklear saç hücreleri, anatomik ve fonksiyonel olarak farklı iki tipten oluşur: dış ve iç tüy hücreleri. Bunlardan herhangi birinin hasar görmesi işitme kaybına neden olur. Özellikle, iç saç hücreleri yenilenemediğinden ve onlara verilen hasar kalıcıdır. Bu nedenle, birincil saç hücrelerinin in vitro olarak yetiştirilmesi, koklear saç hücrelerinin koruyucu veya yenileyici etkilerini araştırmak için vazgeçilmezdir. Bu çalışma, fare kılı hücrelerini izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem keşfetmeyi amaçladı.

Koklear lateral duvarın manuel olarak çıkarılmasından sonra, işitsel epitel koklear modiolden mikroskop altında titizlikle diseke edildi, 37 °C'de 10 dakika boyunca %0.25 tripsin-EDTA'dan oluşan bir karışım içinde inkübe edildi ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılarak kültür ortamında hafifçe süspanse edildi. Hücre süspansiyonu bir hücre filtresinden geçirildi, süzüntü santrifüj edildi ve hücreler 24 oyuklu plakalarda kültürlendi. Saç hücreleri, motor gerilimlerde yer alan bir mekanotransdüksiyon kompleksi olan miyozin-VIIa'yı eksprese etme kapasitelerine ve falloidin kullanılarak F-aktinin seçici etiketlenmesine dayalı olarak tanımlandı. Hücreler kültürde 4 gün sonra% >90 birleşmeye ulaştı. Bu yöntem, in vitro kültürlenmiş saç hücrelerinin biyolojik özellikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir ve koklear saç hücresi kültürlerinin etkinliğini göstererek daha ileri işitsel araştırmalar için sağlam bir metodolojik temel oluşturabilir.

Giriş

Koklear tüy hücreleri, sesin algılanmasında ve işitme sinirine sinyal iletiminde önemli rol oynar. Saç hücreleri, omurgalılarda birincil duyu reseptörleri olarak işlev gören ve ses titreşimlerini elektrik sinyallerine dönüştüren mekanik hücrelerdir. Memeli iç kulağının duyusal epiteli, tek sıra iç tüy hücresi ve üç sıra dış tüy hücresi içerir. Farklı bazik zar bölgelerinde, tüy hücreleri sesleri farklı frekanslarda (20 ila 2.000 Hz arasında) ^algılar1. Dış tüy hücrelerinin işlevi, memeli iç kulağına ince ayar yapmaya yardımcı olan ve sese karşı yüksek hassasiyet sağlayan aktif bir mekanik amplifikasyon işlemidir. İç tüy hücreleri sesleri algılamaktan sorumludur. Dereceli depolarizasyondan sonra, akustik bilgi işitsel sinir lifleri yoluyla beyne iletilir².

İşitme kaybı, dünya çapında önemli bir sağlık sorunu oluşturan genetik kusurlar, yaşlanma, gürültü travması veya ototoksik ilaçların aşırı kullanımından kaynaklanabilir ^3,4. İşitme kaybı esas olarak saç hücrelerinde geri dönüşü olmayan hasardan kaynaklanır⁵. Gürültüye bağlı işitme kaybı ile ilgili olarak, araştırmacılar etiyolojisinin çeşitli ayrıntıları üzerinde fikir birliğine varmış olsalar da, altta yatan çok sayıda mekanizmanın kapsamlı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Dış tüy hücreleri, akustik aşırı maruz kalmaya karşı özellikle savunmasızdır⁶. Mekanosensitif koklear tüy hücreleri yaşa bağlı işitme kaybında rol oynar; Bununla birlikte, saç hücresi dejenerasyonunun altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar bilinmemektedir. Moleküler süreçlerdeki çeşitli değişiklikler, saç hücresi yaşlanmasına, oksidatif strese, DNA hasar tepkisine, otofajiye ve saç hücresi uzmanlığı ile ilgili genlerin ekspresyonunun ve transkripsiyonunun düzensizliğine yol açar⁷.

İç kulak, vücudun en sert kemiğinin derinliklerinde, temporal kemikle kaplı olduğundan, deneysel olarak erişilemez ve tüylü hücre onarımı ve rejenerasyonu mekanizmalarına ilişkin araştırmalara meydan okur. Bu nedenle, saç hücrelerinin işlevini araştırmak için in vitro kültürlerin oluşturulması, iç kulağın yenilenme ve yaralanma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir yöntem haline gelmiştir. Koklear organotipik kültürlerin hazırlanmasına yönelik prosedürler daha önceki çalışmalarda^{tanımlanmıştır 8,9,10}. Dünya çapındaki araştırmacılar çeşitli koklear mikrodiseksiyon ve yüzey hazırlama teknikleri kullanmışlardır. Kalıcı zorluklara rağmen, çeşitli birincil saç hücresi kültürü sistemleri in vitro olarak başarıyla kurulmuştur. Koklear organ kültürleri, tüy hücreleri, Deiter hücreleri, Hensen hücreleri, sütun hücreleri ve işitsel sinir lifleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. Yaralanma sonrası hücresel ve moleküler seviyelerde saç hücrelerindeki değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, daha güçlü araştırma araçlarının geliştirilmesini sağlayacaktır. Bu çalışma, in vitro çalışmalar için yenidoğan farelerden koklear organları izole etme ve bol miktarda tüy hücrelerini enzimatik olarak ayırma adımlarını göstermeyi amaçladı. Kültürlenen hücrelerin doğası, immünofloresan boyama kullanılarak doğrulandı.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Xi'an Jiaotong Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı (No. 2021-847).

1. Sterilizasyon ve malzeme hazırlama

1. Diseksiyon aletlerini yüksek sıcaklık ve yüksek basınçlı buhar dezenfeksiyonu kullanarak sterilize edin ve gece boyunca 50 °C'lik bir inkübatörde kurutun.
2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mg / mL penisilin / streptomisin içeren 100 mL kültür ortamı hazırlayın (90 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (EMEM) 10 mL FBS ve 10 μL penisilin stok çözeltisi ekleyin) önceden ve 4 ° C'de saklayın.

2. İşitsel epitelin toplanması için temporal kemiğin diseksiyonu ve çıkarılması

1. Toplam 10 yenidoğan fareyi (P3 ve P5 yaşları arasında) buz üzerinde dekapitasyon ile ötenazi yapın. Gerekirse alternatif, etik olarak onaylanmış bir metodoloji kullanın.
2. Başı yerinde tutun, mikro ameliyat makası kullanarak kafa derisini sagital sütür boyunca açın ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi kafa derisini parmaklarınızla iki taraflı olarak ayırın ve sabitleyin.
3. Küçük bir periosteal asansör kullanarak beyni çıkarın ve bazal kafatasını ikiye bölün. Kafatasını makasla kesin ve kafatasını açmak için öne doğru çevirin; Beyni kazımak ve kafatasının tabanını ortaya çıkarmak için makasın ucunu kullanın.
4. Kafatasının tabanındaki bilateral temporal kemikleri gözlemleyin (Şekil 1C). Kafatasının tabanını orta hat boyunca kesmek, deriyi kazımak ve gereksiz kemikleri çıkarmak için makas kullanın (Şekil 1D, D').
5. Temporal kemikleri saklayın ve taze Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) içeren 35 mm steril Petri kaplarına aktarın (Şekil 1E).
6. Temporal kemiğin petröz kısmından bül ve çevresindeki dokuyu çıkarmak için iki #5 uçlu forseps kullanın (Şekil 1E).
   NOT: Bu aşamada, farelerin temporal kemiğindeki kemikli labirent tamamen kalsifiye olmayacak ve forseps kullanılarak kolayca diseke edilecektir.
7. Temporal kemiğin yarım daire biçimli kısmını sabitlemek için forsepsleri bir elinizle tutun ve kokleanın lateral kemiğini skala girişinden ayırmak için diğer elinizle forsepsin alt ayağını yuvarlak pencere nişine yapıştırın. OC epiteline dokunmadan temporal kemiğin petröz kısmını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, kokleanın kemikli labirentini bazal uçtan apikal uca dikkatlice ayırın ve çıkarın (Şekil 1F).
8. #5 uçlu forseps kullanarak Corti duyusal epitel organını modiolustan dikkatlice mikro izole edin (Şekil 1G).
9. Spiral ligamenti tutun, mikro çalışma forsepsleri ile stria vaskularisten dikkatlice ayırın ve temiz işitsel epiteli 200 μL'lik bir pipet kullanarak HBSS içeren 3 mm'lik steril bir kültür kabına aktarın (Şekil 1H).
10. Her hayvandan 20 örnek toplayın ve bunları bir sonraki hazırlık adımı için HBSS içeren 100 mm'lik steril bir Petri kabına hızlı bir şekilde aktarın (Şekil 1).

3. İşitsel saç hücreleri elde etmek için enzimatik ayrışma

1. İşitsel epiteli %0.25 tripsin içeren 10 mL taze DMEM'e aktarın ve 37 °C'de 12 dakika inkübe edin.
2. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, saç hücrelerini bazal laminadan ve diğer hücrelerden ameliyat mikroskobu altında nazikçe ayırın.
3. Ayrıştırmayı inhibe etmek için 10 mL daha kültür ortamı ekleyin.
4. Kültür ortamındaki askıdaki hücreleri 70 μm'lik bir filtreden süzün, süzüntüyü 50 mL'lik temiz bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
5. Saç hücrelerini, 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek en az 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Baloncuk sokmaktan kaçının.
6. Altı oyuklu bir plakanın dibine önceden bir lamel yerleştirin. Hücreleri sayın ve altı oyuklu plakalarda 10⁶ hücre / mL yoğunlukta kültürleyin.
7. Yapışık hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2'de₂ mL DMEM'de (% 10 FBS, 100 birim / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içerir) büyütün. Kültür ortamını her gün değiştirin.
   NOT: Bu protokolün kullanılmasının saf saç hücrelerinin elde edilmesiyle sonuçlanmadığı belirtilmelidir. Bu birincil hücre kültürü yöntemine dayanarak, saç hücreleri kültürdeki hücrelerin yaklaşık% 70'ini oluşturabileceğinden ve iyi durumda olabileceğinden, daha ileri çalışmalar için d2 veya d3 hücrelerinin kullanılmasını öneririz.

4. İmmünofloresan boyama

1. Kültürlenmiş hücreleri d1'den d6'ya kadar hasat edin (günde bir kuyu). Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri 2x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
3. Sabitleyiciyi çıkarın ve hücreleri PBS ile 3 x 3 dakika durulayın.
4. RT'de 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 içeren PBS ile hücreleri geçirgenleştirin.
5. Geçirgen hücreleri, RT'de 20 dakika boyunca PBS'de% 10 FBS'den oluşan bir bloke edici çözelti ile inkübe edin.
6. Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de anti-miyozin monoklonal antikoru (PBS'de 1:200'de seyreltilmiş) ile boyayın.
7. Hücreleri 3x steril PBS ile yıkayın ve ikincil antikor (Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan MYO7A, PBS'de 1:500 seyreltilmiş) ve floresein etiketli falloidin (Alexa Fluor 488, hücre yapısını tanımlamak için) ile 2 saat boyunca inkübe edin.
8. İkincil antikorları çıkarmak için hücreleri 3x PBS ile durulayın.
9. Slaytların üzerine DAPI ile 1-2 damla montaj ortamı ekleyin, lamelleri monte edin ve hücrelerin fotoğraflarını çekmek için lazer taramalı konfokal mikroskop altına yerleştirin.

5. İstatistiksel analiz

1. Miyozin-VIIa ve falloidinin gri değerlerinde zaman içinde meydana gelen değişiklikleri analiz etmek için iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'in post hoc testlerini gerçekleştirin. İstatistiksel farklılıkları işaretlemek için harf işaretleme yöntemini kullanın.
2. 1. günden 6. güne kadar hücre örnekleri arasındaki falloidin pozitif hücre oranını ve aynı günlerde miyozin-VII pozitif hücre oranını karşılaştırmak için ek tek yönlü ANOVA'lar ve ardından Tukey'in post-hoc testleri gerçekleştirin.

Sonuçlar

Bu protokolü takiben, izole edilmiş hücreleri tohumladık. Birincil koklear tüy hücresi tohumları, hücreler kültür ortamında yüzmezse ve 24 saat içinde yayılmazsa başarılı kabul edildi. Saç hücrelerinin yapıştıktan ve çanağın dibinde düz agregalara yayıldıktan sonra sayısını belirledik. 1 gün sonra canlı saç hücreleri kültür kabının dibine sıkıca yapıştırıldı ve yapışmayan hücreler PBS ile durulanarak uzaklaştırıldı. Tipik olarak, hücre sayısı 3 günlük kültürden ...

Tartışmalar

HEI-OC1 hücre hattı ile karşılaştırıldığında, saç hücrelerinin birincil kültürleri, hücrelerin fizyolojik durumunu in vivo olarak daha doğru bir şekilde kopyaladı. Bu nedenle, canlı hücrelerin koklear organlardan izole edilmesi ve hemen kültüre edilmesiyle oluşturulan işitsel birincil kültür yöntemi, işitsel sistemler üzerine kapsamlı araştırmalar için değerli bir araç gibi görünmektedir. Başarılı bir kültür için belirli teknikler çok önemlidir. İlk olarak, Corti organının ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture