Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Özet

Koklear tüy hücreleri, işitsel sistemin duyusal reseptörleridir. Bu hücreler, iç kulağın kemik labirenti içinde, işitmeden sorumlu duyu organı olan Corti'nin organında bulunur. Koklear saç hücreleri, anatomik ve fonksiyonel olarak farklı iki tipten oluşur: dış ve iç tüy hücreleri. Bunlardan herhangi birinin hasar görmesi işitme kaybına neden olur. Özellikle, iç saç hücreleri yenilenemediğinden ve onlara verilen hasar kalıcıdır. Bu nedenle, birincil saç hücrelerinin in vitro olarak yetiştirilmesi, koklear saç hücrelerinin koruyucu veya yenileyici etkilerini araştırmak için vazgeçilmezdir. Bu çalışma, fare kılı hücrelerini izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem keşfetmeyi amaçladı.

Koklear lateral duvarın manuel olarak çıkarılmasından sonra, işitsel epitel koklear modiolden mikroskop altında titizlikle diseke edildi, 37 °C'de 10 dakika boyunca %0.25 tripsin-EDTA'dan oluşan bir karışım içinde inkübe edildi ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılarak kültür ortamında hafifçe süspanse edildi. Hücre süspansiyonu bir hücre filtresinden geçirildi, süzüntü santrifüj edildi ve hücreler 24 oyuklu plakalarda kültürlendi. Saç hücreleri, motor gerilimlerde yer alan bir mekanotransdüksiyon kompleksi olan miyozin-VIIa'yı eksprese etme kapasitelerine ve falloidin kullanılarak F-aktinin seçici etiketlenmesine dayalı olarak tanımlandı. Hücreler kültürde 4 gün sonra% >90 birleşmeye ulaştı. Bu yöntem, in vitro kültürlenmiş saç hücrelerinin biyolojik özellikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir ve koklear saç hücresi kültürlerinin etkinliğini göstererek daha ileri işitsel araştırmalar için sağlam bir metodolojik temel oluşturabilir.

Giriş

Koklear tüy hücreleri, sesin algılanmasında ve işitme sinirine sinyal iletiminde önemli rol oynar. Saç hücreleri, omurgalılarda birincil duyu reseptörleri olarak işlev gören ve ses titreşimlerini elektrik sinyallerine dönüştüren mekanik hücrelerdir. Memeli iç kulağının duyusal epiteli, tek sıra iç tüy hücresi ve üç sıra dış tüy hücresi içerir. Farklı bazik zar bölgelerinde, tüy hücreleri sesleri farklı frekanslarda (20 ila 2.000 Hz arasında) ^algılar1. Dış tüy hücrelerinin işlevi, memeli iç kulağına ince ayar yapmaya yardımcı olan ve sese karşı yüksek hassasiyet sağlayan aktif bir mekanik amplifikasyon işlemidir. İç tüy hücreleri sesleri algılam....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Xi'an Jiaotong Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı (No. 2021-847).

1. Sterilizasyon ve malzeme hazırlama

1. Diseksiyon aletlerini yüksek sıcaklık ve yüksek basınçlı buhar dezenfeksiyonu kullanarak sterilize edin ve gece boyunca 50 °C'lik bir inkübatörde kurutun.
2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mg / mL penisilin / streptomisin içeren 100 mL kültür ortamı hazırlayın (90 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (EMEM) 10 mL FBS ve 10 μL penisilin stok çözeltisi ekleyin) önceden ve 4 ° C'de saklayın.

2. İşit....

Tartışmalar

HEI-OC1 hücre hattı ile karşılaştırıldığında, saç hücrelerinin birincil kültürleri, hücrelerin fizyolojik durumunu in vivo olarak daha doğru bir şekilde kopyaladı. Bu nedenle, canlı hücrelerin koklear organlardan izole edilmesi ve hemen kültüre edilmesiyle oluşturulan işitsel birincil kültür yöntemi, işitsel sistemler üzerine kapsamlı araştırmalar için değerli bir araç gibi görünmektedir. Başarılı bir kültür için belirli teknikler çok önemlidir. İlk olarak, Corti organının .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture