Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Resumo

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Resumo

As células ciliadas da cóclea são os receptores sensoriais do sistema auditivo. Essas células estão localizadas no órgão de Corti, órgão sensorial responsável pela audição, dentro do labirinto ósseo da orelha interna. As células ciliadas da cóclea consistem em dois tipos anatomicamente e funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. Danos a qualquer um deles resultam em perda auditiva. Notavelmente, como as células ciliadas internas não podem se regenerar, e os danos a elas são permanentes. Assim, o cultivo in vitro de células ciliadas primárias é indispensável para investigar os efeitos protetores ou regenerativos das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.

Após a remoção manual da parede lateral da cóclea, o epitélio auditivo foi meticulosamente dissecado do modíolo coclear ao microscópio, incubado em uma mistura composta de tripsina-EDTA a 0,25% por 10 min a 37 °C e suavemente suspenso em meio de cultura com ponta de pipeta de 200 μL. A suspensão celular foi passada através de um filtro de células, o filtrado foi centrifugado e as células foram cultivadas em placas de 24 poços. As células ciliadas foram identificadas com base em sua capacidade de expressar um complexo mecanotransdutor, a miosina-VIIa, que está envolvido em tensões motoras, e via marcação seletiva de F-actina usando faloidina. As células atingiram >90% de confluência após 4 dias em cultura. Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vitro e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.

Introdução

As células ciliadas da cóclea desempenham papéis importantes na detecção do som e na transmissão do sinal para o nervo auditivo. As células ciliadas são células mecanicistas que funcionam como receptores sensoriais primários e convertem vibrações sonoras em sinais elétricos em vertebrados. O epitélio sensorial da orelha interna de mamíferos é composto por uma única fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas. Em diferentes áreas da membrana básica, as células ciliadas percebem sons em diferentes frequências (entre 20 e 2.000 Hz)¹. A função das células ciliadas externas é um processo de amplificação mecânica ativa que ajuda a ajustar o ouvido interno dos mamíferos, conferindo alta sensibilidade ao som. As células ciliadas internas são responsáveis pela detecção de sons. Após a despolarização gradual, a informação acústica é transmitida ao cérebro através das fibras do nervo^auditivo2.

A perda auditiva pode ser causada por defeitos genéticos, envelhecimento, trauma sonoro ou uso excessivo de drogas ototóxicas, que constituem um grande problema de saúde em todo o^mundo3,4. A perda auditiva resulta, principalmente, de danos irreversíveis às células ciliadas⁵. Em relação à perda auditiva induzida por ruído, embora os pesquisadores tenham chegado a um consenso sobre vários detalhes de sua etiologia, falta uma compreensão abrangente dos inúmeros mecanismos subjacentes. As células ciliadas externas são particularmente vulneráveis à superexposição acústica⁶. As células ciliadas mecanossensíveis da cóclea estão envolvidas na perda auditiva relacionada à idade; no entanto, os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à degeneração das células ciliadas permanecem desconhecidos. Diversas alterações nos processos moleculares levam ao envelhecimento das células ciliadas, estresse oxidativo, resposta a danos ao DNA, autofagia e desregulação da expressão e transcrição de genes relacionados à especialização das células ciliadas⁷.

Como a orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, ela é experimentalmente inacessível, representando um desafio para as investigações sobre os mecanismos de reparação e regeneração das células ciliadas. Assim, o estabelecimento de culturas in vitro para investigação da função das células ciliadas tornou-se um método ideal para pesquisas sobre os mecanismos de regeneração e lesão da orelha interna. Os procedimentos de preparo das culturas organotípicas da cóclea foram descritos em estudos anteriores ^8,9,10. Pesquisadores em todo o mundo têm empregado várias técnicas de microdissecção coclear e preparação de superfície. Apesar dos desafios persistentes, vários sistemas primários de cultura de células ciliadas foram estabelecidos com sucesso in vitro. As culturas de órgãos cocleares contêm vários tipos de células, incluindo células ciliadas, células de Deiters, células de Hensen, células pilares e fibras do nervo auditivo. Uma compreensão profunda das mudanças nas células ciliadas em nível celular e molecular após a lesão permitirá o desenvolvimento de ferramentas de pesquisa mais poderosas. Este estudo teve como objetivo demonstrar os passos para isolar órgãos cocleares de camundongos neonatais e desprender enzimaticamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados (nº 2021-847) pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Xi'an Jiaotong.

1. Esterilização e preparo do material

1. Esterilizar as ferramentas de dissecção usando desinfecção a vapor de alta temperatura e alta pressão e secá-las em uma incubadora de 50 °C durante a noite.
2. Preparar 100 mL do meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina (adicionar 10 mL de SFB e 10 μL de solução estoque de penicilina a 90 mL de meio de águia modificado (EMEM) de Dulbecco e armazenar a 4 °C.

2. Dissecção e remoção do osso temporal para coleta de epitélios auditivos

1. Eutanásia de um total de 10 camundongos recém-nascidos (com idade entre P3 e P5) por decapitação em gelo. Use uma metodologia alternativa, eticamente aprovada, se necessário.
2. Manter a cabeça posicionada, abrir o couro cabeludo ao longo da sutura sagital com tesoura microoperatória e separar e fixar o couro cabeludo bilateralmente com os dedos, como mostra a Figura 1A.
3. Remova o cérebro usando um pequeno elevador periosteal e bissetriz o crânio basal. Corte o crânio com uma tesoura e vire para frente para abrir o crânio; Use a ponta da tesoura para raspar o cérebro e expor a base do crânio.
4. Observar os ossos temporais bilaterais na base do crânio (Figura 1C). Use tesoura para cortar a base do crânio ao longo da linha média, raspar a pele e remover qualquer osso desnecessário (Figura 1D,D').
5. Reter e transferir os ossos temporais para placas de Petri estéreis de 35 mm contendo solução salina balanceada de Hank fresca (HBSS) (Figura 1E).
6. Utilizar duas pinças de pontas #5 para remover a bula e o tecido circundante da porção petrosa do osso temporal (Figura 1E).
   OBS: Nesta fase, o labirinto ósseo no osso temporal dos camundongos não estaria completamente calcificado e seria facilmente dissecado com pinças.
7. Segure a pinça com uma mão para fixar a parte semicircular do osso temporal e enfie o pé inferior da pinça no nicho da janela redonda com a outra mão para separar o osso lateral da cóclea do vestíbulo da escala. Remover cuidadosamente a porção petrosa do osso temporal sem tocar o epitélio OC. Em seguida, separar e remover cuidadosamente o labirinto ósseo da cóclea da extremidade basal para a extremidade apical (Figura 1F).
8. Microisolar cuidadosamente o órgão do epitélio sensorial de Corti do modíolo usando pinça de pontas #5 (Figura 1G).
9. Segurar o ligamento espiral, separá-lo cuidadosamente da estria vascular com pinças microoperadoras e transferir o epitélio auditivo limpo para uma placa de cultura estéril de 3 mm contendo HBSS usando uma pipeta de 200 μL (Figura 1H).
10. Coletar 20 espécimes de cada animal e transferi-los rapidamente para uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo HBSS para a próxima etapa de preparação (Figura 1).

3. Desagregado enzimático para obtenção de células ciliadas auditivas

1. Transferir o epitélio auditivo para 10 mL de DMEM fresco contendo tripsina a 0,25% e incubar a 37 °C por 12 min.
2. Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, separe suavemente as células ciliadas da lâmina basal e outras células sob um microscópio cirúrgico.
3. Adicionar mais 10 mL de meio de cultura para inibir a desagregação.
4. Filtrar as células em suspensão no meio de cultura através de um filtro de 70 μm, recolher o filtrado num tubo limpo de 50 ml e centrifugar a 300 × g durante 5 minutos.
5. Ressuspender as células ciliadas em pelo menos 5 mL de meio de cultura, pipetando-as suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL. Evite introduzir bolhas.
6. Coloque uma tampa no fundo de uma placa de seis poços com antecedência. Contar as células e cultivá-las a uma densidade de 10^{a 6} células/mL em placas de seis poços.
7. Cultivar as células aderentes em 2 mL de DMEM (contendo 10% de SFB, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C e 5% de CO₂. Mude o meio cultural todos os dias.
   OBS: Deve-se mencionar que a utilização deste protocolo não resulta na obtenção de células ciliadas puras. Com base neste método primário de cultura celular, recomendamos o uso de células d2 ou d3 para estudos posteriores, pois as células ciliadas podem constituir aproximadamente 70% das células em cultura e estar em bom estado.

4. Coloração por imunofluorescência

1. Colher as células cultivadas de d1 a d6 (um poço por dia). Aspirar o meio de cultura e enxaguar as células 2x com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR).
3. Retire o fixador e enxágue as células por 3 x 3 min com PBS.
4. Permeabilizar as células com PBS contendo Triton X-100 a 0,2% por 10 min no TR.
5. Incubar as células permeabilizadas com uma solução de bloqueio composta por SFB a 10% em PBS por 20 min no TR.
6. Manchar as células com anticorpo monoclonal antimiosina (diluído a 1:200 em PBS) a 4 °C durante a noite.
7. Lavar as células 3x com PBS estéril e incubá-las com anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho MYO7A, diluído 1:500 em PBS) e faloidina marcada com fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar a estrutura celular) por 2 h no RT.
8. Enxaguar as células 3x com PBS para remover os anticorpos secundários.
9. Adicione 1-2 gotas de meio de montagem com DAPI nas lâminas, monte as lamínulas e coloque-as sob um microscópio confocal de varredura a laser para capturar fotos das células.

5. Análise estatística

1. Realizar análise de variância (ANOVA) two-way seguida de testes post hoc de Tukey para analisar as mudanças nos valores de cinza de miosina-VIIa e faloidina ao longo do tempo. Use o método de marcação de letras para marcar diferenças estatísticas.
2. Realizar ANOVAs unidirecionais adicionais seguidas de testes post-hoc de Tukey para comparar a razão de células positivas para faloidina entre amostras de células do dia 1 ao dia 6 e a razão de células positivas para miosina VII nos mesmos dias.

Resultados

Seguindo este protocolo, as células isoladas foram semeadas. Sementes de células ciliadas primárias da cóclea foram consideradas bem-sucedidas se as células não flutuassem no meio de cultura e se espalhassem em 24 h. Determinamos o número de células ciliadas após aderirem e se espalharem em agregados planos no fundo da placa. Após 1 dia, as células ciliadas vivas foram firmemente aderidas ao fundo da placa de cultura e as células não aderentes foram removidas por enxágüe com PBS. Tipicamente, o número de ...

Discussão

Em comparação com a linhagem celular HEI-OC1, culturas primárias de células ciliadas replicaram com mais precisão o estado fisiológico das células in vivo. Portanto, o método de cultura primária auditiva estabelecido pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares e sua cultura imediata parece ser uma ferramenta valiosa para uma extensa pesquisa sobre sistemas auditivos. Certas técnicas são cruciais para uma cultura de sucesso. Primeiro, minimizar a duração da separação do órgão de Corti do osso...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture