신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

요약

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

초록

달팽이관 유모 세포는 청각 시스템의 감각 수용체입니다. 이 세포는 청각을 담당하는 감각 기관인 코르티(Corti)의 기관에 있으며, 내이의 골미로(osseous labyrinth)에 있습니다. 달팽이관 유모세포는 해부학적으로나 기능적으로 뚜렷한 두 가지 유형, 즉 바깥쪽 유모세포와 내쪽 유모세포로 구성되어 있습니다. 둘 중 하나가 손상되면 청력 손실이 발생합니다. 특히 내부 유모 세포는 재생될 수 없으며 손상은 영구적입니다. 따라서 일차 유모 세포의 체외 배양은 달팽이관 유모 세포의 보호 또는 재생 효과를 조사하는 데 필수적입니다. 이 연구는 쥐의 유모 세포를 분리하고 배양하는 방법을 발견하는 것을 목표로 했습니다.

달팽이관 측벽을 수동으로 제거한 후, 현미경으로 달팽이관에서 청각 상피를 꼼꼼하게 절개하고, 37°C에서 10분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 구성된 혼합물에서 배양하고, 200μL 피펫 팁을 사용하여 배양 배지에 부드럽게 현탁시켰습니다. 세포 현탁액을 세포 필터를 통과시키고, 여과액을 원심분리하고, 세포를 24웰 플레이트에서 배양하였다. 유모세포는 운동 장력에 관여하는 메카노트랜스덕션 복합체인 미오신-VIIa를 발현하는 능력과 팔로이딘을 사용한 F-액틴의 선택적 표지를 통해 확인되었습니다. 세포는 배양에서 4 일 후 >90 % 합류에 도달했습니다. 이 방법은 체외 배양 유모 세포의 생물학적 특성에 대한 이해를 높이고 달팽이관 유모 세포 배양의 효율성을 입증하여 추가 청각 연구를 위한 견고한 방법론적 기반을 구축할 수 있습니다.

서문

달팽이관 유모 세포는 소리를 감지하고 청각 신경으로 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 유모 세포는 척추 동물의 주요 감각 수용체로 기능하고 소리 진동을 전기 신호로 변환하는 기계론적 세포입니다. 포유류 내이의 감각 상피는 한 줄의 내부 유모 세포와 세 줄의 외부 유모 세포로 구성됩니다. 서로 다른 기본 막 영역에서 유모 세포는 서로 다른 주파수(20Hz에서 2,000Hz ^{사이)에서} 소리를 감지합니다1. 외부 유모 세포의 기능은 포유류의 내이를 미세 조정하는 데 도움이 되는 능동적인 기계적 증폭 과정으로, 소리에 대한 높은 감도를 부여합니다. 내부 유모 세포는 소리를 감지하는 역할을 합니다. 단계적 탈분극 후, 음향 정보는 청각 신경 섬유를 통해 뇌로 전달된다².

청력 손실은 유전적 결함, 노화, 소음 외상 또는 이독성 약물의 과도한 사용으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 전 세계적으로 주요 건강 문제를 구성합니다 ^3,4. 난청은 주로 유모세포의 돌이킬 수 없는 손상으로 인해 발생한다⁵. 소음성 난청과 관....

프로토콜

모든 동물 실험은 Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals의 승인(No. 2021-847)을 받았습니다.

1. 살균 및 재료 준비

1. 고온 및 고압 증기 소독을 사용하여 해부 도구를 멸균하고 50°C 인큐베이터에서 밤새 건조시킵니다.
2. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 10mg/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 배양 배지 100mL를 미리 준비합니다(FBS 10mL와 페니실린 원액 10μL를 Dulbecco's Modified Eagle Medium(EMEM) 90mL에 추가)하고 4°C에서 보관합니다.

2. 청각 상피 채취를 위한 측두골 절제 및 제거

1. 총 10마리의 갓 태어난 쥐(P3에서 P5 사이의 나이)를 얼음 위에서 참수하여 안락사시킵니다. 필요한 경우 윤리적으로 승인된 대체 방법론을 사용합니다.
2. 머리를 제자리에 고정하고 미세 작동 가위를 사용하여 시상 봉합사를 따라 두피를 열고 그림 1A와 같이 손가락으로 두피를 분리....

토론

HEI-OC1 세포주와 비교했을 때, 유모 세포의 1차 배양은 생체 내 세포의 생리학적 상태를 보다 정확하게 복제했습니다. 따라서 달팽이관 기관에서 살아있는 세포를 분리하고 즉시 배양하여 확립된 청각 1차 배양법은 청각 시스템에 대한 광범위한 연구에 유용한 도구로 보입니다. 특정 기술은 성공적인 문화에 매우 중요합니다. 첫째, 측두골에서 코르티 기관이 분리되는 기간을 최소화하면 유모 세포.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture