בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

Summary

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

Abstract

תאי שיער שבלול הם קולטני החישה של מערכת השמע. תאים אלה ממוקמים באיבר של קורטי, איבר החישה האחראי על השמיעה, בתוך מבוך הגלוסקמה של האוזן הפנימית. תאי שיער של השבלול מורכבים משני סוגים שונים מבחינה אנטומית ותפקודית: תאי שיער חיצוניים ופנימיים. נזק לכל אחד מהם גורם לאובדן שמיעה. יש לציין כי תאי השערה הפנימיים אינם יכולים להתחדש, והנזק להם הוא קבוע. לפיכך, טיפוח במבחנה של תאי שיער ראשוניים הוא הכרחי לחקר ההשפעות המגינות או המתחדשות של תאי שיער שבלול. מחקר זה נועד לגלות שיטה לבידוד וטיפוח תאי שיער של עכברים.

לאחר הסרה ידנית של דופן השבלול הצידית, אפיתל השמע נותח בקפידה מהמודיולוס השבלול תחת מיקרוסקופ, הודגר בתערובת המורכבת מ-0.25% טריפסין-EDTA למשך 10 דקות ב-37°C, והושעה בעדינות בתווך תרבית באמצעות קצה פיפטה של 200 μL. תרחיף התאים הועבר דרך מסנן תאים, התסנין היה צנטריפוגי, והתאים גודלו בתרבית בלוחות של 24 בארות. תאי השערה זוהו על סמך יכולתם לבטא קומפלקס מכנוטרנסדוקציה, מיוזין-VIIa, המעורב במתחים מוטוריים, ובאמצעות תיוג סלקטיבי של F-אקטין באמצעות פאלואדין. התאים הגיעו למפגש של >90% לאחר 4D בתרבית. שיטה זו יכולה לשפר את הבנתנו את המאפיינים הביולוגיים של תאי שיער בתרבית חוץ גופית ולהדגים את היעילות של תרביות תאי שיער שבלול, ולבסס בסיס מתודולוגי מוצק למחקר שמיעתי נוסף.

Introduction

תאי שיער של השבלול ממלאים תפקידים חשובים בזיהוי צלילים ובהעברת אותות לעצב השמיעה. תאי שיער הם תאים מכניסטיים המתפקדים כקולטני חישה ראשוניים וממירים תנודות קול לאותות חשמליים בבעלי חוליות. אפיתל החישה של האוזן הפנימית של היונקים מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים. באזורים בסיסיים שונים בממברנה, תאי השערה קולטים צלילים בתדרים שונים (בין 20 ל-2,000 הרץ)¹. תפקידם של תאי השערה החיצוניים הוא תהליך הגברה מכני פעיל המסייע לכוונן את האוזן הפנימית של היונקים, ומעניק רגישות גבוהה לקול. תאי השערה הפנימיים אחראים על זיהוי צלילים. לאחר דפולריזציה מדורגת, מידע אקוסטי מועבר למוח דרך סיבי עצב השמיעה².

ליקוי שמיעה עלול להיגרם על ידי פגמים גנטיים, הזדקנות, טראומה לרעש או שימוש מופרז בתרופות אוטוטוקסיות, המהוות דאגה בריאותית מרכזית ברחבי העולם ^3,4. ליקוי שמיעה נובע בעיקר מנזק בלתי הפיך לתאי השערה⁵. בנוגע לאובדן שמיעה הנגרם כתוצאה מרעש, למרות שהחוקרים הגיעו להסכמה על מספר פרטים של האטיולוגיה שלו, חסרה הבנה מקיפה של המנגנונים הבסיסיים הרבים. תאי השערה החיצוניים פגיעים במיוחד לחשיפת יתר אקוסטית⁶. תאי שיער שבלול רגישים למכנו מעורבים באובדן שמיעה הקשור לגיל; עם זאת, המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס ניוון תאי השערה עדיין אינם ידועים. מספר שינויים בתהליכים המולקולריים מובילים להזדקנות תאי שיער, עקה חמצונית, תגובת נזק לדנ"א, אוטופגיה וחוסר ויסות של ביטוי ושעתוק גנים הקשורים להתמחות תאי השערה⁷.

מכיוון שהאוזן הפנימית עטופה בעצם הרקתית, עמוק בעצם הקשה ביותר בגוף, היא אינה נגישה באופן ניסיוני, מה שמציב אתגר לחקירת מנגנוני התיקון וההתחדשות של תאי השערה. לפיכך, הקמת תרביות חוץ גופיות לחקר תפקודם של תאי השערה הפכה לשיטה אידיאלית למחקר על מנגנוני ההתחדשות והפציעה של האוזן הפנימית. ההליכים להכנת תרביות אורגנוטיפיות שבלול תוארו במחקרים קודמים ^8,9,10. חוקרים ברחבי העולם השתמשו בטכניקות שונות של מיקרודיסקציה של שבלול והכנת פני שטח. למרות האתגרים המתמשכים, מערכות שונות של תרביות תאי שיער ראשוניות הוקמו בהצלחה במבחנה. תרביות איברי שבלול מכילות סוגי תאים שונים, כולל תאי שיער, תאי דייטר, תאי הנסן, תאי עמוד וסיבי עצב שמיעתיים. הבנה מעמיקה של השינויים בתאי השערה ברמה התאית והמולקולרית לאחר פציעה תאפשר פיתוח כלי מחקר חזקים יותר. מחקר זה נועד להדגים את השלבים לבידוד איברי השבלול מעכברי יילודים ולניתוק אנזימטי של תאי השערה השופעים לצורך מחקרי מבחנה. אופי התאים בתרבית אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו (מס' 2021-847) על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג.

1. עיקור והכנת חומרים

1. יש לעקר את כלי הדיסקציה באמצעות חיטוי קיטור בטמפרטורה גבוהה ובלחץ גבוה ולייבש אותם באינקובטור של 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. הכינו מראש 100 מ"ל של מדיום התרבית המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-10 מ"ג/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (הוסיפו 10 מ"ל FBS ו-10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פניצילין ל-90 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (EMEM) של דולבקו) ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.

2. דיסקציה והסרה של העצם הטמפורלית לאיסוף אפיתל שמיעתי

1. הרדימו מספר כולל של 10 עכברים שזה עתה נולדו (בגילאי P3 ו-P5) על ידי עריפת ראשים על קרח. השתמש במתודולוגיה חלופית שאושרה מבחינה אתית, במידת הצורך.
2. החזיקו את הראש במקומו, פתחו את הקרקפת לאורך תפר הקשת באמצעות מספריים מיקרו-ניתוחיים, הפרידו וקיבעו את הקרקפת באופן דו-צדדי עם האצבעות, כפי שמוצג באיור 1A.
3. הסר את המוח באמצעות מעלית פריאוסטאלית קטנה וחתך את גולגולת הבסיס. חותכים את הגולגולת במספריים והופכים קדימה כדי לפתוח את הגולגולת; השתמש בקצה המספריים כדי לגרד את המוח ולחשוף את בסיס הגולגולת.
4. התבוננו בעצמות הרקתיות הדו-צדדיות בבסיס הגולגולת (איור 1C). השתמשו במספריים כדי לחתוך את בסיס הגולגולת לאורך קו האמצע, לגרד את העור ולהסיר עצם מיותרת (איור 1D,D').
5. שמרו והעבירו את העצמות הרקתיות לצלחות פטרי סטריליות בקוטר 35 מ"מ המכילות תמיסת מלח מאוזנת טרייה של האנק (HBSS) (איור 1E).
6. השתמשו בשני מלקחיים מחודדים #5 כדי להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מהחלק הפטרוסי של העצם הרקתית (איור 1E).
   הערה: בשלב זה, המבוך הגרמי בעצם הרקתית של העכברים לא יסתייד לחלוטין וניתן יהיה לנתח אותו בקלות באמצעות מלקחיים.
7. החזיקו את המלקחיים ביד אחת כדי לקבע את החלק החצי עגול של העצם הרקתית ותקעו את כף הרגל התחתונה של המלקחיים בגומחת החלון העגולה ביד השנייה כדי להפריד את העצם הצידית של השבלול מפרוזדור הסקאלה. בזהירות להסיר את החלק petrous של העצם הטמפורלית מבלי לגעת אפיתל OC. לאחר מכן, הפרידו בזהירות והסרו את המבוך הגרמי של השבלול מהקצה הבסיסי לקצה האפי (איור 1F).
8. בזהירות מיקרו לבודד את האיבר של אפיתל חושי קורטי מן modiolus באמצעות מלקחיים #5 מחודדים (איור 1G).
9. אחזו ברצועה הספירלית, הפרידו אותה בזהירות מהסטריה וסקולריס בעזרת מלקחיים מיקרו-ניתוחיים, והעבירו את אפיתל השמע הנקי לצלחת תרבית סטרילית בקוטר 3 מ"מ המכילה HBSS באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר (איור 1H).
10. אספו 20 דגימות מכל חיה והעבירו אותן במהירות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ שמכילה HBSS לשלב ההכנה הבא (איור 1).

3. דיסאגרגציה אנזימטית לקבלת תאי שיער שמיעתיים

1. להעביר את אפיתל השמיעה ל 10 מ"ל של DMEM טרי המכיל 0.25% טריפסין לדגור ב 37 ° C במשך 12 דקות.
2. בעזרת קצה פיפטה של 200 μL, מפרידים בעדינות את תאי השערה מהלמינה הבסיסית ותאים אחרים תחת מיקרוסקופ פעיל.
3. הוסף עוד 10 מ"ל של מדיום תרבית כדי לעכב את disaggregation.
4. מסננים את התאים המרחפים בתווך התרבית דרך מסנן 70 מיקרומטר, אוספים את התסנין בצינור נקי של 50 מ"ל וצנטריפוגות אותו ב 300 × גרם למשך 5 דקות.
5. יש להשהות מחדש את תאי השערה בלפחות 5 מ"ל של מדיום תרבית על ידי הקפאתם בעדינות מעלה ומטה באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. הימנעו מהחדרת בועות.
6. מניחים מראש מכסה בתחתית צלחת בת שש בארות. ספרו את התאים ותרבו אותם בצפיפות של 10⁶ תאים / מ"ל בלוחות של שש בארות.
7. לגדל את התאים הדבקים ב 2 מ"ל של DMEM (המכיל 10% של FBS, 100 יחידות / מ"ל של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין) ב 37 ° C ו 5% CO₂. לשנות את המדיום התרבותי כל יום.
   הערה: יש לציין כי שימוש בפרוטוקול זה אינו מביא לקבלת תאי שיער טהורים. בהתבסס על שיטת תרבית תאים ראשונית זו, אנו ממליצים להשתמש בתאי d2 או d3 למחקרים נוספים, שכן תאי שיער עשויים להוות כ-70% מהתאים בתרבית ולהיות במצב טוב.

4. צביעה אימונופלואורסצנטית

1. קצרו את התאים בתרבית מ-d1 עד d6 (באר אחת ביום). שאפו את מדיום התרבית ושטפו תאים פי 2 במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
2. תקן תאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. הסר את התאים המקבעים ושטוף במשך 3 x 3 דקות עם PBS.
4. חדרו את התאים עם PBS המכיל 0.2% Triton X-100 למשך 10 דקות ב-RT.
5. לדגור את התאים permeabilized עם פתרון חסימה המורכב של 10% FBS ב PBS במשך 20 דקות ב RT.
6. הכתימו את התאים בנוגדן חד-שבטי אנטי-מיוזין (מדולל ב-1:200 ב-PBS) ב-4°C למשך הלילה.
7. שטפו את התאים 3x עם PBS סטרילי ודגרו עליהם עם נוגדן משני (Alexa Fluor 594 עז נגד ארנב MYO7A, מדולל 1:500 ב-PBS) ופלואידין עם תווית פלואורסצאין (Alexa Fluor 488, כדי לזהות את מבנה התא) במשך שעתיים ב-RT.
8. שטפו את התאים 3x עם PBS כדי להסיר את הנוגדנים המשניים.
9. הוסף 1-2 טיפות של אמצעי הרכבה עם DAPI על המגלשות, הרכיב את הכיסויים והנח אותם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר כדי לצלם תמונות של התאים.

5. ניתוח סטטיסטי

1. בצע ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו בדיקות פוסט-הוק של Tukey כדי לנתח את השינויים בערכים האפורים של מיוזין-VIIa ופאלואידין לאורך זמן. השתמש בשיטת סימון האותיות כדי לסמן הבדלים סטטיסטיים.
2. בצע ANOVAs חד-כיווניים נוספים ולאחר מכן בדיקות פוסט-הוק של Tukey כדי להשוות את יחס התאים החיוביים לפאלואידין בין דגימות תאים מיום 1 ליום 6 לבין יחס התאים החיובי מיוזין-VII באותם ימים.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה, זרענו את התאים המבודדים. זרעים ראשוניים של תאי שערת שבלול נחשבו מוצלחים אם התאים לא צפו בתווך התרבית והתפשטו תוך 24 שעות. קבענו את מספר תאי השערה לאחר שהם נדבקו והתפשטו לצברים שטוחים בתחתית המנה. לאחר יום אחד, תאי שיער חיים הודבקו בחוזקה לתחתית צלחת התרבית ותאים שאינם נדב...

Discussion

בהשוואה לקו התאים HEI-OC1, תרביות ראשוניות של תאי שיער שכפלו בצורה מדויקת יותר את המצב הפיזיולוגי של תאים in vivo. לכן, שיטת התרבית הראשונית השמיעתית שנקבעה על ידי בידוד תאים חיים מאיברי השבלול וטיפוחם המיידי נראית ככלי רב ערך למחקר מקיף על מערכות שמיעתיות. טכניקות מסוימות חיוניות לתרבות מצליחה....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture