العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا Preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر

Summary

هنا ، نصف العزلة والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر ، مما يسمح بدراسة وظيفة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية وعلاقتها بالخلايا الوعائية.

Abstract

الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) هي مستودع للأنسجة الدهنية يحيط بالأوعية الدموية ويعرض الأنماط الظاهرية للخلايا الشحمية البيضاء والبيج والبني. ألقت الاكتشافات الحديثة الضوء على الدور المركزي ل PVAT في تنظيم التوازن الوعائي والمشاركة في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. إن الفهم الشامل لخصائص PVAT وتنظيمها له أهمية كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية. تعتبر الثقافات الأولية للخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر ذات قيمة لدراسة وظيفة PVAT والحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر والخلايا الوعائية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا اقتصاديا ومجديا للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لنمذجة تكوين الدهون أو تكوين الدهون في المختبر. يحدد البروتوكول معالجة الأنسجة وتمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر من الفئران الصغيرة. سيوفر هذا البروتوكول حجر الزاوية التكنولوجي في جانب مقاعد البدلاء للتحقيق في وظيفة PVAT.

Introduction

يعتقد أن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، وهي بنية حول الأوعية تتكون من خليط من الخلايا الشحمية الناضجة وجزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، تتفاعل مع جدار الوعاء المجاور عبر إفرازها^{بشكل شبه مكراني 1}. كمنظم حاسم للتوازن الوعائي ، فإن خلل PVAT متورط في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية²،^3،4. يتكون SVF لأنسجة الخلايا الشحمية من العديد من مجموعات الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا المناعية وخلايا الظهارة المتوسطة والخلايا العصبية والخلايا الجذعية الدهنية والخلايا السلفية (ASPCs)^5,6

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مستشفى شنغهاي للصدر التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم الموافقة: KS23010) وكانت متوافقة مع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. يفضل ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 4-8 أسابيع لهذه التجربة.

1. إعداد الأدوات الجراحية ، والمخازن المؤقتة ، ووسائط الثقافة

1. أدوات الأوتوكلاف الجراحية (مثل المقص الجراحي والملقط القياسي) عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تطهير الأدوات المجهرية مع الكحول 75 ٪.
2. تحضير محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل ب 1٪ v / v بنسلين-ستربتومايسين و 10 مل أخرى من PBS مكملة ب 10٪....

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول الموصوف أعلاه ، قمنا بعزل PVATs بعناية حول الأبهر الصدري للفأر (الشكل 1A-D). بعد غسل وفرم PVATs إلى قطع صغيرة باستخدام مقص معقم (الشكل 1E ، F) ، تم هضم شظايا الأنسجة في محلول هضم يحتوي على كولاجيناز من النوع الأول (1 مجم / مل) و dispase II (4 .......

Discussion

نقترح نهجا عمليا وممكنا للعزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر. مزايا هذا البروتوكول هي أنه بسيط واقتصادي. تعد الأعداد الكافية من الفئران ضرورية للعزل الناجح ، حيث يمكن أن تؤدي الأنسجة غير الكافية إلى انخفاض كثافة SVF وضعف حالة النمو ، مما يؤثر ف.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001