Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Özet

Perivasküler yağ dokusu (PVAT), kan damarlarını çevreleyen ve beyaz, bej ve kahverengi adipositlerin fenotiplerini sergileyen bir yağ dokusu deposudur. Son keşifler, PVAT'ın vasküler homeostazın düzenlenmesinde ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezine katılmadaki merkezi rolüne ışık tutmuştur. PVAT özelliklerinin ve regülasyonunun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT fonksiyonunu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki karışmayı incelemek için değerlidir. Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için ekonomik ve uygulanabilir bir protokol sunmaktadır ve bu, in vitro adipogenez veya lipogenezin modellenmesi için yararlı olabilir. Protokol, genç farelerden periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol, PVAT işlevinin araştırılması için tezgah tarafında teknolojik temel taşı sağlayacaktır.

Giriş

Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır1. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar 2,3,4. Adiposit dokusunun SVF'si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC'ler) dahil olmak üzere birkaç bek....

Protokol

Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir.

1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması

  1. Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Mikrocerrahi aletleri% 75 alkol ile dezenfekte edin.
  2. % 1 v / v penisilin-streptomisin ve% 10 v / v penisilin-streptomisin ile deste....

Temsili Sonuçlar

Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT'leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT'lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (

Tartışmalar

Fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu için pratik ve uygulanabilir bir yaklaşım öneriyoruz. Bu protokolün avantajları basit ve ekonomik olmasıdır. Başarılı izolasyon için yeterli sayıda fare kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz doku düşük SVF yoğunluğuna ve zayıf büyüme durumuna neden olabilir ve sonuçta lipojenik verimliliği etkileyebilir. Ek olarak, SVF'nin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azaldığı için fare yaşı.......

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri finansal veya başka türlü herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130012 ve 81830010) ve Şanghay Göğüs Hastanesi'nin temel araştırmaları için Yetiştirme projeleri (Hibe Numarası: 2022YNJCQ03) tarafından desteklenmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filtersPALL4612
12-well plate Labselect11210
15 mL centrifuge tubeLabserv310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)Sigma-AldrichT-28771 nM
50 mL centrifuge tubeLabselectCT-002-50A
anti-adiponectinAbcamab225541:1,000 working concentration
anti-COX IVCST48501:1,000 working concentration
anti-FABP4CST21201:1,000 working concentration
anti-PGC1αAbcamab1918381:1,000 working concentration
anti-PPARγInvitrogenMA5-148891:1,000 working concentration
anti-UCP1Abcamab109831:1,000 working concentration
anti-α-ActininCST64871:1,000 working concentration
BSABeyotimeST023-200g1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexesShanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylonFalcon352350
Collagen from calf skinSigma-AldrichC8919
Collagenase, Type 1WorthingtonLS0041961 mg/mL
DexamethasoneSigma-AldrichD17561 μM
Dispase IISigma-AldrichD4693-1G4 mg/mL
Fetal bovine serum Gibco16000-04410%
HEPESSigma-AldrichH4034-25G20 mM
High glucose DMEMHycloneSH30022.01
IBMX Sigma-AldrichI70180.5 mM
Incubator with orbital shakerShanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.LYZ-103B
Insulin (cattle) Sigma-Aldrich11070-73-81 μM
IsofluraneRWDR510-22-10
Krebs-Ringer's SolutionPricella PB180347protect from light 
Microsurgical forcepsBeyotimeFS233
Microsurgical scissorBeyotimeFS217
Oil Red O Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdA600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdB548117-0500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 115-035-1461:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 111-035-1441:5,000 working concentration
RosiglitazoneSigma-AldrichR24081 μM
Standard forcepsBeyotimeFS225
Surgical scissorBeyotimeFS001

Referanslar

  1. Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
  2. Huang, C. L., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.