Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Resumo

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Resumo

O tecido adiposo perivascular (PVAT) é um depósito de tecido adiposo que envolve os vasos sanguíneos e exibe os fenótipos de adipócitos brancos, beges e marrons. Descobertas recentes têm lançado luz sobre o papel central do PVAT na regulação da homeostase vascular e participação na patogênese das doenças cardiovasculares. Uma compreensão abrangente das propriedades e regulação do PVAT é de grande importância para o desenvolvimento de terapias futuras. Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para estudar a função do PVAT e o crosstalk entre adipócitos periaórticos e células vasculares. Este trabalho apresenta um protocolo econômico e viável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, que pode ser útil para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro. O protocolo descreve o processamento tecidual e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos periaórticos de camundongos jovens. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada para a investigação da função PVAT.

Introdução

Acredita-se que o tecido adiposo perivascular (PVAT), uma estrutura perivascular composta por uma mistura de adipócitos maduros e uma fração vascular estromal (FVS), interaja com a parede do vaso adjacente através de seu secretoma paracrineamente¹. Como regulador crítico da homeostase vascular, a disfunção do PVAT está implicada na patogênese das doenças^{cardiovasculares2,3,4}. A FNS do tecido adipocitário consiste de várias populações celulares esperadas, incluindo células endoteliais, células imunes, células mesoteliais, células neuronais e células-tronco adiposas e progenitoras (ASPCs)^5,6. Sabe-se que as ASPCs residentes na FVS do tecido adiposo podem dar origem a adipócitos maduros⁵. Infere-se que a FVS seja uma fonte crítica de adipócitos maduros em PVAT. Vários estudos têm demonstrado que o PVAT-SVF pode se diferenciar em adipócitos maduros sob condições específicas de indução ^6,7,8.

Atualmente, existem dois sistemas de isolamento para isolar a FSV do tecido adiposo, um é a digestão enzimática e o outro é o não^enzimático9. Métodos enzimáticos tipicamente resultam em maior rendimento de células progenitoras nucleadas¹⁰. Até o momento, os benefícios da FVS em promover regeneração vascular e neovascularização na cicatrização de feridas, doenças urogenitais e cardiovasculares têm sido amplamente demonstrados11, especialmente na dermatologia e na cirurgia^{plástica12,13}. No entanto, as perspectivas de aplicação clínica da FV derivada do PVAT ainda não foram bem exploradas, o que pode ser atribuído à falta de um método padronizado para o isolamento da FVS do PVAT. O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA a partir de PVAT de camundongos ao redor da aorta torácica, permitindo uma investigação mais aprofundada da função da PVAT. Este protocolo otimiza técnicas de processamento tecidual e diferenciação celular para cultura de adipócitos periaórticos obtidos de camundongos jovens.

Protocolo

Os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Shanghai Chest Hospital, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (número de aprovação: KS23010) e estavam em conformidade com os regulamentos éticos relevantes. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 4-8 semanas devem ser preferidos para este experimento.

1. Preparo de instrumentais cirúrgicos, tampões e meios de cultura

1. Ferramentas cirúrgicas em autoclave (por exemplo, tesoura cirúrgica e pinça padrão) a 121 °C por 30 min. Desinfetar os instrumentos microcirúrgicos com álcool a 75%.
2. Preparar solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) suplementada com penicilina-estreptomicina a 1% v/v e mais 10 mL de PBS suplementado com penicilina-estreptomicina a 10% v/v.
   NOTA: Nas seções a seguir, se não for especificamente mencionado, PBS refere-se a PBS estéril regular.
3. Preparar tampão Krebs Ringer HEPES BSA: albumina de soro bovino (BSA) a 1%, HEPES 20 mM dissolvido em solução de Krebs Ringer.
4. Preparar solução de digestão fresca: colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) dissolvida em tampão Krebs Ringer HEPES BSA. Esterilizar a solução com um filtro de 0,2 μm.
5. Prepare uma placa de 12 poços revestida de colágeno.
   1. Diluir a solução de colágeno (1 mg/mL) com água deionizada estéril até a concentração de 40 μg/mL. Adicionar 1 ml da solução de colagénio diluída na superfície de cada poço para atingir uma concentração de 6-10 μg/cm². Incubar o revestimento durante 1 h à temperatura ambiente.
   2. Retire a solução restante e lave cada poço 2x com 1 mL de PBS. Use a placa imediatamente ou seque a placa ao ar em uma capela de fluxo laminar classe II e armazene a placa revestida a 2-8 °C. Ao armazenar, sele as placas revestidas com parafilme.
6. Preparar meio de cultura: meio Dulbecco's Modified Eagles (DMEM) com alto teor de glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% v/v penicilina-estreptomicina. Manter a 4 °C até 2 semanas.
7. Preparar meio de indução lipogênico: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM, insulina 1 μM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (IBMX) e dexametasona 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.
8. Preparar meio de manutenção: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM e insulina a 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.

2. Dissecção e isolamento do tecido adiposo perivascular (PVAT)

1. Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia com isoflurano a 2% ou com overdose de dióxido de carbono. Borrifar com álcool 75% para desinfecção da pele.
2. Coloque o rato em decúbito dorsal horizontal (virado para cima).
3. Levante a pele, faça uma pequena incisão e separe sem rodeios a pele e os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média ventral da pelve até o pescoço. Exponha o coração e os pulmões cortando o diafragma e as costelas ao longo de ambos os lados da linha média.
4. Remova cuidadosamente o fígado, baço, intestinos e rins. Evite cortar a parede intestinal.
5. Remova os pulmões e o esôfago.
6. Levante suavemente o coração com pinça em uma mão e separe a aorta da coluna vertebral com tesoura cirúrgica na outra mão. Em seguida, colocar o coração e a aorta em uma placa de Petri de 60 mm com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.
7. Retire a pinça microcirúrgica e a tesoura microcirúrgica do álcool e enxágue em 25 mL de PBS para remover o excesso de álcool. Sob um microscópio estéreo, remova o timo e outros tecidos do coração e da aorta, em seguida, remova o coração, deixando a aorta com os PVATs.
8. Transferir a aorta com os PVATs para uma placa de Petri limpa de 60 mm com PBS contendo 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
9. Utilizar pinças microcirúrgicas para retirar os PVATs, com um par de pinças fixando a aorta e a outra arrancando o tecido adiposo. Remova o tecido da vasculatura tanto quanto possível, minimizando os danos ao tecido adiposo perivascular.
10. Coletar o PVAT ao redor da aorta torácica no tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo DMEM com alto teor de glicose suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% v/v colocado sobre gelo.

3. Isolamento da fração vascular estromal (FVS)

1. Enxaguar sequencialmente os tecidos coletados com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 10% v/v e PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.
   NOTA: A partir desta etapa, todos os experimentos devem ser realizados em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar classe II.
2. Transfira os tecidos para uma placa de Petri estéril de 60 mm, adicione 200 μL de solução de digestão e pique-os em pedaços de 1 mm³ usando tesoura estéril.
3. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma ponta de pipeta de plástico, a extremidade alargada por um corte de tesoura estéril, e adicione 6 mL de solução de digestão para iniciar a reação de digestão.
   NOTA: Uma reação de digestão (3 mL de solução de digestão) é suficiente para depósitos de PVAT de seis camundongos.
4. Incubar os tecidos a 37 °C numa estufa com um agitador orbital (frequência de 150 rpm para uma mistura eficaz) durante 30-45 minutos. Amarre os tubos em um rack para fazer os tubos tremerem horizontalmente. Agite para cima e para baixo vigorosamente com a mão por 10 s a cada 5-10 min.
   NOTA: A digestão pode ser interrompida quando um fluido digestivo homogêneo e amarelado é visto sem fragmentos de tecido restantes.
5. Coar os tecidos digeridos através de um filtro celular de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL. Enxaguar o filtro celular com um volume igual de meio de cultura para maximizar o rendimento celular e interromper a digestão.
6. Transfira o filtrado para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 1.800 × g por 10 min. Inverter o tubo para descartar o sobrenadante e ressuspender os pellets em 5 mL de PBS. Centrifugar a 1.800 × g por 5 min.
7. Descarte o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspenda os pellets em volume apropriado de meio de cultura.
   NOTA: Os pellets celulares coletados de cada seis camundongos são ressuspensos em 1 mL de meio de cultura e semeados em um poço de uma placa de 12 poços.
8. Semeando as células em uma placa de 12 poços revestida de colágeno e incubar a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO₂ durante a noite.
9. No dia seguinte, aspirar o meio de cultura, lavar as células com PBS pré-aquecido (37 °C) contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v para remover restos celulares e hemácias e adicionar de volta 1 mL de meio de cultura fresco em cada poço.

4. Indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA do tecido adiposo periaórtico

1. Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam ~60-70% de confluência.
   NOTA: Geralmente leva 3-4 dias para que as células atinjam 60-70% de confluência.
2. Quando as células atingirem 60-70% de confluência, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por meio de indução adipogênico marrom. Considerar o dia de indução da diferenciação adipogênica como o dia 0 da diferenciação.
3. Após 72 h (dia 3 de diferenciação), refrescar o meio com o meio de manutenção. Troque o meio de manutenção a cada 2 dias até que as células sejam usadas para experimentos.
4. Analisar as células adipogênicas de forma adequada, como coloração Oil Red O¹⁴ e western blotting¹⁵.

Resultados

Usando este protocolo descrito acima, isolamos cuidadosamente os PVATs ao redor de aortas torácicas de camundongos (Figura 1A-D). Após lavagem e picagem dos PVATs em pequenos pedaços com tesoura estéril (Figura 1E,F), os fragmentos de tecido foram digeridos em solução de digestão contendo colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) e incubados a 37 °C em agitador por 30-45 min (Figura 1G).

Discussão

Propomos uma abordagem prática e viável para o isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FSV do tecido adiposo periaórtico de camundongos. As vantagens deste protocolo são que ele é simples e econômico. Um número adequado de camundongos é crítico para o sucesso do isolamento, pois tecido insuficiente pode resultar em baixa densidade de FSV e baixo estado de crescimento, afetando a eficiência lipogênica. Além disso, a idade dos camundongos é um fator importante a ser considerado, po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001