Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Resumo

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Resumo

O tecido adiposo perivascular (PVAT) é um depósito de tecido adiposo que envolve os vasos sanguíneos e exibe os fenótipos de adipócitos brancos, beges e marrons. Descobertas recentes têm lançado luz sobre o papel central do PVAT na regulação da homeostase vascular e participação na patogênese das doenças cardiovasculares. Uma compreensão abrangente das propriedades e regulação do PVAT é de grande importância para o desenvolvimento de terapias futuras. Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para estudar a função do PVAT e o crosstalk entre adipócitos periaórticos e células vasculares. Este trabalho apresenta um protocolo econômico e viável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, que pode ser útil para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro. O protocolo descreve o processamento tecidual e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos periaórticos de camundongos jovens. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada para a investigação da função PVAT.

Introdução

Acredita-se que o tecido adiposo perivascular (PVAT), uma estrutura perivascular composta por uma mistura de adipócitos maduros e uma fração vascular estromal (FVS), interaja com a parede do vaso adjacente através de seu secretoma paracrineamente¹. Como regulador crítico da homeostase vascular, a disfunção do PVAT está implicada na patogênese das doenças^{cardiovasculares2,3,4}. A FNS do tecido adipocitário consiste de várias populações celulares esperadas, incluindo células endoteliais, células imunes, células mesoteliais, células neuronais e células-tro....

Protocolo

Os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Shanghai Chest Hospital, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (número de aprovação: KS23010) e estavam em conformidade com os regulamentos éticos relevantes. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 4-8 semanas devem ser preferidos para este experimento.

1. Preparo de instrumentais cirúrgicos, tampões e meios de cultura

1. Ferramentas cirúrgicas em autoclave (por exemplo, tesoura cirúrgica e pinça padrão) a 121 °C por 30 min. Desinfetar os instrumentos microcirúrgicos com álcool a....

Discussão

Propomos uma abordagem prática e viável para o isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FSV do tecido adiposo periaórtico de camundongos. As vantagens deste protocolo são que ele é simples e econômico. Um número adequado de camundongos é crítico para o sucesso do isolamento, pois tecido insuficiente pode resultar em baixa densidade de FSV e baixo estado de crescimento, afetando a eficiência lipogênica. Além disso, a idade dos camundongos é um fator importante a ser considerado, po.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001