从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养和诱导基质血管部分来源的前脂肪细胞

摘要

在这里，我们描述了从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养和诱导基质血管部分来源的前脂肪细胞，从而可以研究血管周围脂肪组织功能及其与血管细胞的关系。

摘要

血管周围脂肪组织 （PVAT） 是一种围绕血管的脂肪组织库，表现出白色、米色和棕色脂肪细胞的表型。最近的发现揭示了PVAT在调节血管稳态和参与心血管疾病发病机制中的核心作用。全面了解PVAT特性和调控对于未来疗法的开发非常重要。主动脉周围脂肪细胞的原代培养对于研究PVAT功能以及主动脉周围脂肪细胞与血管细胞之间的串扰很有价值。本文提出了一种经济可行的方案，用于从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养和诱导基质血管部分来源的前脂肪细胞，可用于 体外模拟脂肪生成或脂肪生成。该方案概述了用于培养年轻小鼠主动脉周围脂肪细胞的组织处理和细胞分化。该协议将为研究PVAT功能提供工作台侧的技术基石。

引言

血管周围脂肪组织 （PVAT） 是一种由成熟脂肪细胞和基质血管部分 （SVF） 混合物组成的血管周围结构，被认为通过其分泌组旁分泌与相邻血管壁相互作用¹。作为血管稳态的关键调节因子，PVAT 功能障碍与心血管疾病的发病机制有关 ^2,3,4。脂肪细胞组织的 SVF 由几个预期的细胞群组成，包括内皮细胞、免疫细胞、间皮细胞、神经元细胞以及脂肪干细胞和祖细胞 （ASPC）^5,6。众所周知，存在于脂肪组织SVF中的ASPC可以产生成熟的脂肪细胞⁵。SVF 被推断为 PVAT 中成熟脂肪细胞的关键来源。多项研究表明，PVAT-SVF 可以在特定的诱导条件下分化为成熟的脂肪细胞 ^6,7,8。

目前，从脂肪组织中分离SVF有两种分离系统，一种是酶消化，另一种是非酶^9。

研究方案

动物用药方案经上海交通大学医学院附属上海胸科医院机构动物护理与使用委员会批准（批准文号：KS23010），符合相关伦理规范。4-8周龄的雄性和雌性C57BL / 6小鼠是该实验的首选。

1. 手术工具、缓冲液和培养基的制备

1. 将手术工具（例如手术剪刀和标准镊子）在121°C高压灭菌30分钟。用75%酒精对显微外科器械进行消毒。
2. 制备补充有 1% v/v 青霉素 - 链霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和另外 10 mL 补充有 10% v/v 青霉素 - 链霉素的 PBS。
   注意：在以下各节中，如果没有特别提及，PBS 是指常规无菌 PBS。
3. 制备克雷布斯林格HEPES BSA缓冲液：1%牛血清白蛋白（BSA），20mM HEPES溶解在克雷布斯林格溶液中。
4. 制备新鲜消化溶液：1型胶原酶（1mg / mL）和分散酶II（4mg / mL）溶解在Krebs Ringer HEPES BSA缓冲液中。使用0.2μm过滤器对溶液进行灭菌。
5. 准备胶原蛋白包被的 12 孔板。
   1. 用无菌去离子水稀释胶原蛋白溶液（1mg / mL）至40μg/ mL的浓度。在每个孔的表面加入 1 mL 稀释的胶原蛋白溶液，以达到 6-10 μg/^{cm 2} 的浓度。将涂层在室温下孵育1小时。
   2. 取出剩余的溶液，用 ....

讨论

我们提出了一种实用可行的方法，用于从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离和诱导SVF来源的前脂肪细胞。该协议的优点是简单且经济。足够数量的小鼠对于成功分离至关重要，因为组织不足会导致 SVF 密度低和生长状态不佳，最终影响脂肪生成效率。此外，小鼠年龄是一个需要考虑的重要因素，因为SVF的成脂潜力随着年龄的增长而降低。快速、仔细地分离PVAT，同时最大限度地减少脉管系统的污染至?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001