Isolement, culture et induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris

Résumé

Ici, nous décrivons l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, permettant l’étude de la fonction du tissu adipeux périvasculaire et de sa relation avec les cellules vasculaires.

Résumé

Le tissu adipeux périvasculaire (TVAP) est un dépôt de tissu adipeux qui entoure les vaisseaux sanguins et présente les phénotypes d’adipocytes blancs, beiges et bruns. Des découvertes récentes ont mis en lumière le rôle central de la PVAT dans la régulation de l’homéostasie vasculaire et la participation à la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Une compréhension globale des propriétés et de la réglementation de la PVAT est d’une grande importance pour le développement de thérapies futures. Les cultures primaires d’adipocytes périaortiques sont précieuses pour étudier la fonction PVAT et la diaphonie entre les adipocytes périaortiques et les cellules vasculaires. Cet article présente un protocole économique et réalisable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, qui peut être utile pour la modélisation de l’adipogenèse ou de la lipogenèse in vitro. Le protocole décrit le traitement tissulaire et la différenciation cellulaire pour la culture des adipocytes périaortiques à partir de jeunes souris. Ce protocole constituera la pierre angulaire technologique de la paillasse pour l’étude de la fonction PVAT.

Introduction

On pense que le tissu adipeux périvasculaire (TVAP), une structure périvasculaire composée d’un mélange d’adipocytes matures et d’une fraction vasculaire stromale (SVF), interagit avec la paroi vasculaire adjacente via son sécrétome paracriné^. En tant que régulateur essentiel de l’homéostasie vasculaire, le dysfonctionnement de la PVAT est impliqué dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires ^2,3,4. La SVF du tissu adipocytaire est constituée de plusieurs populations cellulaires attendues, notamment des cellules endothéliales, des cellules immunitaires, des cellules mésothéliennes, des cellules neuronales et des cellules souches et progénitrices adipeuses (ASPC)^5,6. Il est bien connu que les ASPC résidant dans le SVF du tissu adipeux peuvent donner naissance à des adipocytes matures⁵. On en déduit que la SVF est une source critique d’adipocytes matures dans la PVAT. Plusieurs études ont montré que PVAT-SVF peut se différencier en adipocytes matures dans des conditions d’induction spécifiques ^6,7,8.

Actuellement, il existe deux systèmes d’isolement pour isoler le SVF du tissu adipeux, l’un est la digestion enzymatique et l’autre est non enzymatique⁹. Les méthodes enzymatiques entraînent généralement un rendement plus élevé de cellules progénitrices nucléées¹⁰. À ce jour, les avantages de la SVF dans la promotion de la régénération vasculaire et de la néovascularisation dans la cicatrisation des plaies, les maladies urogénitales et cardiovasculaires ont été largement démontrés¹¹, en particulier en dermatologie et en chirurgie plastique^12,13. Cependant, les perspectives d’application clinique de la SVF dérivée de la PVAT n’ont pas été bien explorées, ce qui peut être attribué à l’absence d’une méthode standardisée pour isoler la SVF de la PVAT. L’objectif de ce protocole est d’établir une approche standardisée pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la SVF à partir de PVAT murins entourant l’aorte thoracique, permettant une étude plus approfondie de la fonction PVAT. Ce protocole optimise les techniques de traitement tissulaire et de différenciation cellulaire pour la culture d’adipocytes périaortiques obtenus à partir de jeunes souris.

Protocole

Les protocoles pour animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital thoracique de Shanghai, affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (numéro d’approbation : KS23010) et étaient conformes aux réglementations éthiques pertinentes. Les souris mâles et femelles C57BL/6 âgées de 4 à 8 semaines sont à privilégier pour cette expérience.

1. Préparation des outils chirurgicaux, des tampons et des milieux de culture

1. Autoclaver les outils chirurgicaux (p. ex., ciseaux chirurgicaux et pinces standard) à 121 °C pendant 30 min. Désinfecter les instruments microchirurgicaux avec de l’alcool à 75 %.
2. Préparer une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) additionnée de 1 % v/v de pénicilline-streptomycine et 10 mL de PBS additionnée de 10 % v/v de pénicilline-streptomycine.
   REMARQUE : Dans les sections suivantes, si elle n’est pas spécifiquement mentionnée, PBS fait référence à PBS stérile ordinaire.
3. Préparer le tampon Krebs Ringer HEPES BSA : 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 20 mM d’HEPES dissous dans une solution Krebs Ringer.
4. Préparer une solution de digestion fraîche : collagénase de type 1 (1 mg/mL) et dispase II (4 mg/mL) dissoutes dans le tampon Krebs Ringer HEPES BSA. Stériliser la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
5. Préparez une plaque à 12 puits enrobée de collagène.
   1. Diluer la solution de collagène (1 mg/mL) avec de l’eau stérile déminéralisée à la concentration de 40 μg/mL. Ajouter 1 mL de la solution de collagène diluée à la surface de chaque puits pour obtenir une concentration de 6 à 10 μg/cm². Incuber l’enrobage pendant 1 h à température ambiante.
   2. Retirez le reste de la solution et rincez chaque puits 2 fois avec 1 mL de PBS. Utilisez la plaque immédiatement ou séchez-la à l’air libre dans une hotte à flux laminaire de classe II et stockez la plaque revêtue à une température comprise entre 2 et 8 °C. Lors du stockage, scellez les plaques revêtues avec du parafilm.
6. Milieu de culture : milieu d’aigles modifié par Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose, sérum de veau fœtal (FBS) à 10 %, pénicilline-streptomycine à 1 % v/v. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
7. Préparer un milieu d’induction lipogénique : DMEM à haute teneur en glucose, FBS à 10 %, pénicilline-streptomycine à 1 v/v, triiodothyronine à 1 nM, rosiglitazone à 1 μM, insuline à 1 μM, 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) à 0,5 mM et dexaméthasone à 1 μM. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
8. Préparer le milieu d’entretien : DMEM à haute teneur en glucose, 10 % de FBS, 1 % v/v de pénicilline-streptomycine, 1 nM de triiodothyronine, 1 μM de rosiglitazone et 1 μM d’insuline. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.

2. Dissection et isolement du tissu adipeux périvasculaire (TVAP)

1. Euthanasier la souris par luxation cervicale sous anesthésie à 2 % d’isoflurane ou par surdosage en dioxyde de carbone. Vaporiser avec de l’alcool à 75% pour la désinfection de la peau.
2. Placez la souris en décubitus dorsal (face vers le haut).
3. Soulevez la peau, faites une petite incision et séparez carrément la peau et les muscles abdominaux avec des ciseaux chirurgicaux le long de la ligne médiane ventrale, du bassin au cou. Exposez le cœur et les poumons en coupant le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane.
4. Retirez soigneusement le foie, la rate, les intestins et les reins. Évitez de couper la paroi intestinale.
5. Retirez les poumons et l’œsophage.
6. Soulevez doucement le cœur avec une pince dans une main et séparez l’aorte de la colonne vertébrale avec des ciseaux chirurgicaux dans l’autre main. Ensuite, placez le cœur et l’aorte dans une boîte de Pétri de 60 mm avec du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine.
7. Retirer les pinces microchirurgicales et les ciseaux microchirurgicaux de l’alcool et rincer dans 25 ml de PBS pour éliminer l’excès d’alcool. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, retirez le thymus et d’autres tissus du cœur et de l’aorte, puis retirez le cœur, en laissant l’aorte avec les TVAP.
8. Transférez l’aorte avec les PVAT dans une boîte de Pétri propre de 60 mm avec du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine.
9. Utilisez des pinces microchirurgicales pour enlever les PVAT, avec une paire de pinces fixant l’aorte et l’autre retirant le tissu adipeux. Retirez le tissu vasculaire autant que possible tout en minimisant les dommages au tissu adipeux périvasculaire.
10. Recueillir la PVAT entourant l’aorte thoracique dans le tube de microcentrifugation de 2 mL contenant du DMEM à haute teneur en glucose complété par de la pénicilline-streptomycine à 1 % v/v placé sur de la glace.

3. Isolement de la fraction vasculaire stromale (FVS)

1. Rincez séquentiellement les tissus prélevés avec du PBS contenant 10 % v/v de pénicilline-streptomycine et du PBS contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine.
   REMARQUE : À partir de cette étape, toutes les expériences doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire de classe II.
2. Transférez les tissus dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm, ajoutez 200 μL de solution de digestion et hachez-les en³ morceaux de 1 mm à l’aide de ciseaux stériles.
3. Transférez le mélange dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’un embout de pipette en plastique, l’extrémité élargie par une coupe en ciseaux stérile, et ajoutez 6 mL de solution de digestion pour démarrer la réaction de digestion.
   REMARQUE : Une réaction de digestion (3 mL de solution de digestion) est suffisante pour les dépôts de PVAT de six souris.
4. Incuber les tissus à 37 °C dans un incubateur avec un agitateur orbital (fréquence de 150 tr/min pour un mélange efficace) pendant 30 à 45 min. Attachez les tubes à plat sur une grille pour les faire trembler horizontalement. Agiter vigoureusement de haut en bas à la main pendant 10 s toutes les 5 à 10 minutes.
   REMARQUE : La digestion peut être interrompue lorsqu’un liquide digestif homogène et jaunâtre est observé sans fragments de tissu.
5. Filtrer les tissus digérés à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube à centrifuger de 50 ml. Rincez la crépine cellulaire avec un volume égal de milieu de culture pour maximiser le rendement cellulaire et arrêter la digestion.
6. Transvaser le filtrat dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 1 800 × g pendant 10 min. Retournez le tube pour éliminer le surnageant et remettre les pastilles en suspension dans 5 mL de PBS. Centrifuger à 1 800 × g pendant 5 min.
7. Éliminez le surnageant en retournant le tube et remettez les pastilles en suspension dans un volume approprié de milieu de culture.
   REMARQUE : Les pastilles cellulaires prélevées sur six souris sont remises en suspension dans 1 mL de milieu de culture et ensemencées dans un puits d’une plaque de 12 puits.
8. Ensemencez les cellules dans une plaque à 12 puits recouverte de collagène et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO₂ pendant la nuit.
9. Le lendemain, aspirer le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) contenant 1 % v/v de pénicilline-streptomycine pour éliminer les débris cellulaires et les globules rouges, et ajouter 1 mL de milieu de culture frais à chaque puits.

4. Induction adipogénique de préadipocytes dérivés de SVF à partir du tissu adipeux périaortique

1. Changez le milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent ~60-70% de confluence.
   REMARQUE : Il faut généralement 3 à 4 jours pour que les cellules atteignent 60 à 70% de confluence.
2. Lorsque les cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par un milieu d’induction adipogénique brun. Considérons le jour de l’induction de la différenciation adipogénique comme le jour 0 de la différenciation.
3. Après 72 h (jour 3 de différenciation), rafraîchir le milieu avec du milieu d’entretien. Changez le milieu d’entretien tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules soient utilisées pour les expériences.
4. Analysez les cellules adipogéniques de manière appropriée, comme la coloration Oil Red O¹⁴ et le western blot¹⁵.

Résultats

À l’aide de ce protocole décrit ci-dessus, nous avons soigneusement isolé les PVAT entourant les aortes thoraciques de souris (Figure 1A-D). Après avoir lavé et haché les PVAT en petits morceaux à l’aide de ciseaux stériles (Figure 1E,F), des fragments de tissu ont été digérés dans une solution de digestion contenant de la collagénase de type 1 (1 mg/mL) et de la dispase II (4 mg/mL) et incubés à 37 °C sur un agitateur pe...

Discussion

Nous proposons une approche pratique et réalisable pour l’isolement et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de SVF à partir de tissu adipeux périaortique de souris. Les avantages de ce protocole sont qu’il est simple et économique. Un nombre adéquat de souris est essentiel pour un isolement réussi, car un tissu insuffisant peut entraîner une faible densité de SVF et un mauvais état de croissance, affectant finalement l’efficacité lipogénique. De plus, l’âge de la souris est un facte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001