בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

Summary

במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, התרבית והאינדוקציה האידיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם בשברי כלי דם סטרומה מרקמת השומן הפריאו-אורטית של עכבר, מה שמאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם.

Abstract

רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT) היא מחסן רקמת שומן המקיף כלי דם ומציג את הפנוטיפים של אדיפוציטים לבנים, בז' וחומים. תגליות אחרונות שפכו אור על התפקיד המרכזי של PVAT בוויסות הומאוסטזיס כלי הדם והשתתפות בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. הבנה מקיפה של תכונות PVAT ורגולציה היא בעלת חשיבות רבה לפיתוח טיפולים עתידיים. תרביות ראשוניות של אדיפוציטים פריאורטיים הן בעלות ערך לחקר תפקוד PVAT וההצלבה בין אדיפוציטים פריאורטיים ותאי כלי דם. מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני וישים לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם במקטע כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר, אשר יכול להיות שימושי למידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה במבחנה. הפרוטוקול מתאר עיבוד רקמות והתמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים מעכברים צעירים. פרוטוקול זה יספק את אבן הפינה הטכנולוגית בצד הספסל לחקירת תפקוד PVAT.

Introduction

רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT), מבנה פריווסקולרי המורכב מתערובת של אדיפוציטים בוגרים ומקטע כלי דם סטרומה (SVF), הוא האמין אינטראקציה עם דופן כלי הדם הסמוך באמצעות ההפרשה שלה^{paracrineally 1}. כמווסת קריטי של הומאוסטזיס כלי דם, תפקוד לקוי של PVAT מעורב בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם ^2,3,4. SVF של רקמת השומן מורכב ממספר אוכלוסיות תאים צפויות, כולל תאי אנדותל, תאי חיסון, תאי מזותליום, תאים עצביים ותאי גזע ותאי אב שומניים (ASPCs)^5,6. ידוע היטב כי ASPCs השוכנים ב- SVF של רקמת השומן יכולים להצמיח אדיפוציטים בוגרים⁵. SVF מוסק להיות מקור קריטי של אדיפוציטים בוגרים PVAT. מספר מחקרים הראו כי PVAT-SVF יכול להתמיין לאדיפוציטים בוגרים בתנאי אינדוקציה ספציפיים ^6,7,8.

כיום קיימות שתי מערכות בידוד לבידוד SVF מרקמת השומן, האחת היא עיכול אנזימטי והשנייה אינה אנזימטית⁹. שיטות אנזימטיות בדרך כלל מביאות לתשואה גבוהה יותר של תאי אב בעלי גרעין¹⁰. עד כה, היתרונות של SVF בקידום התחדשות כלי הדם וניאו-וסקולריזציה בריפוי פצעים, מחלות אורוגניטליות ומחלות לב וכלי דם הוכחו באופן נרחב¹¹, במיוחד בדרמטולוגיה ובכירורגיה פלסטית^12,13. עם זאת, סיכויי היישום הקליני של SVF הנגזר מ- PVAT לא נחקרו היטב, וניתן לייחס זאת להיעדר שיטה סטנדרטית לבידוד SVF מ- PVAT. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס גישה סטנדרטית לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מ-PVAT עכברי סביב אבי העורקים החזי, מה שיאפשר חקירה נוספת של תפקוד PVAT. פרוטוקול זה מייעל את עיבוד רקמות וטכניקות התמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים המתקבלים מעכברים צעירים.

Protocol

הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים החזה בשנחאי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (מספר אישור: KS23010) ועמדו בתקנות האתיות הרלוונטיות. יש להעדיף עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בגילאי 4-8 שבועות לניסוי זה.

1. הכנת כלים כירורגיים, חוצצים ומדיה תרבותית

1. כלים כירורגיים אוטוקלאביים (למשל, מספריים כירורגיים ומלקחיים סטנדרטיים) בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות. חיטוי מכשירים מיקרוכירורגיים עם 75% אלכוהול.
2. הכינו מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) בתוספת 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ועוד 10 מ"ל של PBS בתוספת 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
   הערה: בסעיפים הבאים, אם לא הוזכר במפורש, PBS מתייחס PBS סטרילי רגיל.
3. הכינו את מאגר קרבס רינגר HEPES BSA: אלבומין 1% בסרום בקר (BSA), 20 mM HEPES מומס בתמיסת קרבס רינגר.
4. הכינו תמיסת עיכול טרייה: collagenase מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ו-dispase II (4 מ"ג/מ"ל) מומסים במאגר Krebs Ringer HEPES BSA. יש לעקר את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
5. הכינו צלחת מצופה קולגן עם 12 בארות.
   1. יש לדלל את תמיסת הקולגן (1 מ"ג/מ"ל) במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה עד לריכוז של 40 מק"ג/מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת הקולגן המדולל על פני כל באר כדי להשיג ריכוז של 6-10 מיקרוגרם / ס"מ². דוגרים על הציפוי במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   2. הסר את התמיסה הנותרת ושטוף כל באר 2x עם 1 מ"ל של PBS. השתמש בצלחת מיד, או יבש את הצלחת באוויר במכסה מנוע זרימה למינרית Class II ואחסן את הצלחת המצופה ב 2-8 ° C. בעת אחסון, לאטום את לוחות מצופים עם parafilm.
6. הכינו מדיום תרבית: גלוקוז גבוה Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM), 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
7. הכן אמצעי השראה ליפוגני: DMEM גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין, 1 ננומטר triiodothyronine, 1 μM rosiglitazone, 1 μM אינסולין, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), ו 1 μM dexamethasone. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
8. הכן אמצעי תחזוקה: DMEM גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין, 1 ננומטר triiodothyronine, 1 μM rosiglitazone, ו 1 מיקרומטר אינסולין. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.

2. דיסקציה ובידוד של רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT)

1. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם תחת הרדמה איזופלורנית 2% או עם מנת יתר של פחמן דו חמצני. יש לרסס עם 75% אלכוהול לחיטוי העור.
2. הנח את העכבר במצב שכיבה (פונה כלפי מעלה).
3. הרימו את העור, בצעו חתך קטן והפרידו בבוטות בין העור לשרירי הבטן בעזרת מספריים כירורגיים לאורך קו האמצע הגחוני מהאגן ועד הצוואר. חשוף את הלב והריאות על ידי חיתוך הסרעפת והצלעות לאורך שני צידי קו האמצע.
4. הסר בזהירות את הכבד, הטחול, המעיים והכליות. הימנע חיתוך דופן המעי.
5. הסר את הריאות ואת הוושט.
6. הרימו בעדינות את הלב עם מלקחיים ביד אחת והפרידו את אבי העורקים מעמוד השדרה בעזרת מספריים כירורגיים ביד השנייה. לאחר מכן, הניחו את הלב ואבי העורקים בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ עם PBS המכילה 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
7. הסר מלקחיים מיקרוכירורגיים ומספריים מיקרוכירורגיים מאלכוהול ושטוף ב -25 מ"ל של PBS כדי להסיר את עודף האלכוהול. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר את בלוטת התימוס ורקמות אחרות מהלב ומאבי העורקים, ולאחר מכן הסר את הלב, והשאיר את אבי העורקים עם PVATs.
8. מעבירים את אבי העורקים עם PVAT לצלחת פטרי נקייה בקוטר 60 מ"מ עם PBS המכילה 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
9. השתמש במלקחיים מיקרוכירורגיים כדי להפשיט PVATs, כאשר זוג אחד של מלקחיים מתקן את אבי העורקים והשני מושך את רקמת השומן. הסר את רקמת כלי הדם ככל האפשר תוך מזעור הנזק לרקמת השומן ההיקפית.
10. אספו את ה-PVAT המקיף את אבי העורקים החזי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין המונח על קרח.

3. בידוד של מקטע כלי דם סטרומה (SVF)

1. יש לשטוף את הרקמות שנאספו ברצף עם PBS המכיל 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ו-PBS המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.
   הערה: משלב זה ואילך, כל הניסויים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית סוג II.
2. מעבירים את הרקמות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מ"מ, מוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת עיכול וטוחנים אותן ל-1 מ"מ³ חתיכות באמצעות מספריים סטריליים.
3. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק, שקצהו מורחב על ידי חיתוך מספריים סטרילי, ומוסיפים 6 מ"ל של תמיסת עיכול כדי להתחיל את תגובת העיכול.
   הערה: תגובת עיכול אחת (3 מ"ל של תמיסת עיכול) מספיקה למחסני PVAT משישה עכברים.
4. לדגור את הרקמות ב 37 ° C באינקובטור עם שייקר מסלולית (תדר 150 סל"ד לערבוב יעיל) במשך 30-45 דקות. קשרו את הצינורות בצורה שטוחה על מתלה כדי לגרום לצינורות לרעוד אופקית. נערו מעלה ומטה במרץ ביד במשך 10 שניות כל 5-10 דקות.
   הערה: ניתן להפסיק את העיכול כאשר נוזל עיכול הומוגני וצהבהב נראה ללא שברי רקמות.
5. מסננים את הרקמות המעוכלות דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. שטפו את מסננת התאים בנפח שווה של מדיום תרבית כדי למקסם את תפוקת התאים ולעצור את העיכול.
6. מעבירים את התסנין לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 10 דקות. הפוך את הצינור כדי להשליך את supernatant ו resuspend את הכדורים ב 5 מ"ל של PBS. צנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 5 דקות.
7. השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצינור והשעו מחדש את הכדוריות בנפח מתאים של מדיום תרבית.
   הערה: כדורי התא שנאספו מכל שישה עכברים מושעים מחדש ב-1 מ"ל של מדיום תרבית ונזרעים לבאר אחת של צלחת בת 12 בארות.
8. זרעו את התאים לתוך צלחת מצופה קולגן של 12 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה עם 5%_CO2 למשך הלילה.
9. למחרת, שאפו את מדיום התרבית, שטפו את התאים עם PBS שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין כדי להסיר פסולת תאים ותאי דם אדומים, והוסיפו בחזרה 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי כל באר.

4. אינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית

1. שנה את מדיום התרבית כל יומיים עד שהתאים מגיעים ~ 60-70% מפגש.
   הערה: בדרך כלל לוקח 3-4 ימים לתאים להגיע למפגש של 60-70%.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 60-70%, שואפים את מדיום התרבית ומחליפים אותו בתווך אינדוקציה אדיפוגני חום. שקול את יום האינדוקציה של התמיינות אדיפוגנית כיום 0 של התמיינות.
3. לאחר 72 שעות (יום 3 של בידול), רענן את המדיום עם אמצעי תחזוקה. שנה את אמצעי התחזוקה כל יומיים עד שהתאים ישמשו לניסויים.
4. לנתח את התאים האדיפוגניים בצורה מתאימה, כגון שמן אדום O צביעה¹⁴ ו blotting המערבי¹⁵.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה שתואר לעיל, בודדנו בקפידה PVAT סביב אבי העורקים החזי של עכבר (איור 1A-D). לאחר שטיפה וטחינה של PVAT לחתיכות קטנות באמצעות מספריים סטריליים (איור 1E,F), שברי רקמות עוכלו בתמיסת עיכול שהכילה collagenase מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ו-dispase II (4 מ"ג/מ"ל) והודגרו ...

Discussion

אנו מציעים גישה מעשית וישימה לבידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית של עכבר. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא פשוט וחסכוני. מספר מספיק של עכברים הוא קריטי לבידוד מוצלח, שכן רקמה לא מספקת עלולה לגרום לצפיפות SVF נמוכה ולמצב גדילה ירוד, מה שבסופו של דבר מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001