Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

요약

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

초록

혈관 주위 지방 조직(PVAT)은 혈관을 둘러싸고 흰색, 베이지색 및 갈색 지방 세포의 표현형을 나타내는 지방 조직 저장소입니다. 최근의 발견은 혈관 항상성을 조절하고 심혈관 질환의 발병에 참여하는 PVAT의 중심적인 역할을 조명했습니다. PVAT 특성 및 규제에 대한 포괄적인 이해는 미래 치료법 개발에 매우 중요합니다. 대동맥 주위 지방세포의 1차 배양은 PVAT 기능과 대동맥 주위 지방세포와 혈관 세포 간의 누화를 연구하는 데 유용합니다. 이 논문은 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방생성 유도를 위한 경제적이고 실현 가능한 프로토콜을 제시하며, 이는 시험관 내 지방 형성 또는 지방 형성 모델링에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 어린 마우스에서 대동맥 주위 지방 세포를 배양하기 위한 조직 처리 및 세포 분화를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 PVAT 기능 조사를 위한 벤치 측의 기술적 초석을 제공할 것입니다.

서문

성숙한 지방세포와 기질혈관분획(SVF)의 혼합물로 구성된 혈관주위 구조인 혈관주위 지방조직(PVAT)은 분비체를 통해 인접한 혈관벽과 상호작용하는 것으로 여겨진다¹. 혈관 항상성의 중요한 조절자인 PVAT 기능 장애는 심혈관 질환의 발병기전과 관련이 있습니다 ^2,3,4. 지방 세포 조직의 SVF는 내피 세포, 면역 세포, 중피 세포, 신경 세포, 지방 줄기 및 전구 세포(ASPC^)를 포함한 여러 예상 세포 집단으로 구성됩니다^5,6. 지방 조직의 SVF에 존재하는 ASPC가 성숙한 지방 세포를 발생시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다⁵. SVF는 PVAT에서 성숙한 지방 세포의 중요한 공급원으로 추론됩니다. 여러 연구에 따르면 PVAT-SVF는 특정 유도 조건 ^6,7,8에서 ....

프로토콜

동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 부속 상하이 흉부 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: KS23010)의 승인을 받았으며 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 이 실험에는 4-8주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스가 선호된다.

1. 수술 도구, 완충액 및 배양 배지의 준비

1. 수술 도구(예: 수술용 가위 및 표준 집게)를 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 미세 수술 기구를 75% 알코올로 소독합니다.
2. 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)와 10% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 또 다른 10mL의 PBS를 준비합니다.
   알림: 다음 섹션에서 구체적으로 언급되지 않은 경우 PBS는 일반 멸균 PBS를 나타냅니다.
3. Krebs Ringer HEPES BSA 완충액 준비: 1% 소 혈청 알부민(BSA), Krebs Ringer 용액에 용해된 20mM HEPES.
4. 신선한 분해 용액 준비: Krebs Ringer HEPES BSA 완충액에 용해된 유형 1 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 dispase II(4mg/mL). 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다....

토론

우리는 마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리 및 지방 유도를 위한 실용적이고 실현 가능한 접근 방식을 제안합니다. 이 프로토콜의 장점은 간단하고 경제적이라는 것입니다. 조직이 부족하면 SVF 밀도가 낮아지고 성장 상태가 좋지 않아 궁극적으로 지방 생성 효율에 영향을 미칠 수 있으므로 적절한 수의 마우스가 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 또한 마우스 나이는 SVF?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001