Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

요약

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

초록

혈관 주위 지방 조직(PVAT)은 혈관을 둘러싸고 흰색, 베이지색 및 갈색 지방 세포의 표현형을 나타내는 지방 조직 저장소입니다. 최근의 발견은 혈관 항상성을 조절하고 심혈관 질환의 발병에 참여하는 PVAT의 중심적인 역할을 조명했습니다. PVAT 특성 및 규제에 대한 포괄적인 이해는 미래 치료법 개발에 매우 중요합니다. 대동맥 주위 지방세포의 1차 배양은 PVAT 기능과 대동맥 주위 지방세포와 혈관 세포 간의 누화를 연구하는 데 유용합니다. 이 논문은 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방생성 유도를 위한 경제적이고 실현 가능한 프로토콜을 제시하며, 이는 시험관 내 지방 형성 또는 지방 형성 모델링에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 어린 마우스에서 대동맥 주위 지방 세포를 배양하기 위한 조직 처리 및 세포 분화를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 PVAT 기능 조사를 위한 벤치 측의 기술적 초석을 제공할 것입니다.

서문

성숙한 지방세포와 기질혈관분획(SVF)의 혼합물로 구성된 혈관주위 구조인 혈관주위 지방조직(PVAT)은 분비체를 통해 인접한 혈관벽과 상호작용하는 것으로 여겨진다¹. 혈관 항상성의 중요한 조절자인 PVAT 기능 장애는 심혈관 질환의 발병기전과 관련이 있습니다 ^2,3,4. 지방 세포 조직의 SVF는 내피 세포, 면역 세포, 중피 세포, 신경 세포, 지방 줄기 및 전구 세포(ASPC^)를 포함한 여러 예상 세포 집단으로 구성됩니다^5,6. 지방 조직의 SVF에 존재하는 ASPC가 성숙한 지방 세포를 발생시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다⁵. SVF는 PVAT에서 성숙한 지방 세포의 중요한 공급원으로 추론됩니다. 여러 연구에 따르면 PVAT-SVF는 특정 유도 조건 ^6,7,8에서 성숙한 지방 세포로 분화할 수 있습니다.

현재 지방 조직에서 SVF를 분리하기 위한 두 가지 분리 시스템이 있는데, 하나는 효소 소화이고 다른 하나는 비효소^{분해입니다 9}. 효소적 방법은 전형적으로 핵이 형성된 전구세포(nucleated progenitor cell)의 수율을 높인다(¹⁰). 현재까지 상처 치유, 비뇨생식기 및 심혈관 질환에서 혈관 재생 및 신생혈관 형성을 촉진하는 SVF의 이점은 특히 피부과 및 성형 외과에서 널리 입증되었습니다^{11 12,13}. 그러나 PVAT 유래 SVF의 임상 적용 전망은 잘 탐구되지 않았으며, 이는 PVAT에서 SVF를 분리하기 위한 표준화된 방법이 없기 때문일 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 흉부 대동맥을 둘러싼 마우스 PVAT에서 SVF 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방생성 유도를 위한 표준화된 접근 방식을 확립하여 PVAT 기능에 대한 추가 조사를 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 어린 마우스에서 얻은 대동맥 주위 지방 세포를 배양하기 위한 조직 처리 및 세포 분화 기술을 최적화합니다.

프로토콜

동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 부속 상하이 흉부 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: KS23010)의 승인을 받았으며 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 이 실험에는 4-8주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스가 선호된다.

1. 수술 도구, 완충액 및 배양 배지의 준비

1. 수술 도구(예: 수술용 가위 및 표준 집게)를 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 미세 수술 기구를 75% 알코올로 소독합니다.
2. 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)와 10% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 또 다른 10mL의 PBS를 준비합니다.
   알림: 다음 섹션에서 구체적으로 언급되지 않은 경우 PBS는 일반 멸균 PBS를 나타냅니다.
3. Krebs Ringer HEPES BSA 완충액 준비: 1% 소 혈청 알부민(BSA), Krebs Ringer 용액에 용해된 20mM HEPES.
4. 신선한 분해 용액 준비: Krebs Ringer HEPES BSA 완충액에 용해된 유형 1 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 dispase II(4mg/mL). 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다.
5. 콜라겐 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다.
   1. 콜라겐 용액(1mg/mL)을 멸균 탈이온수로 40μg/mL 농도로 희석합니다. 각 웰의 표면에 희석된 콜라겐 용액 1mL를 첨가하여 6-10μg/^cm2의 농도를 얻습니다. 실온에서 1시간 동안 코팅을 배양합니다.
   2. 남은 용액을 제거하고 PBS 1mL로 각 웰을 2번 헹굽니다. 플레이트를 즉시 사용하거나 클래스 II 층류 후드에서 플레이트를 자연 건조하고 코팅된 플레이트를 2-8°C에서 보관하십시오. 보관할 때는 코팅된 플레이트를 파라필름으로 밀봉하십시오.
6. 배양 배지 준비: 고포도당 Dulbecco's-Modified Eagles 배지(DMEM), 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신. 최대 2주 동안 4 °C에서 보관하십시오.
7. 고포도당 DMEM, 10% FBS, 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 1nM 트리요오드티로닌, 1μM 로시글리타존, 1μM 인슐린, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 및 1μM 덱사메타손. 최대 2주 동안 4 °C에서 보관하십시오.
8. 유지 배지 준비: 고포도당 DMEM, 10% FBS, 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 1nM 트리요오드티로닌, 1μM 로시글리타존 및 1μM 인슐린. 최대 2주 동안 4 °C에서 보관하십시오.

2. 혈관 주위 지방 조직(PVAT)의 해부 및 분리

1. 2% 이소플루란 마취 또는 이산화탄소 과다 투여로 자궁경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다. 피부 소독을 위해 75% 알코올을 뿌립니다.
2. 마우스를 누운 자세(위쪽을 향함)에 놓습니다.
3. 피부를 들어 올려 작은 절개를 하고 골반에서 목까지 복부 정중선을 따라 수술용 가위로 피부와 복부 근육을 뭉툭하게 분리합니다. 정중선의 양쪽을 따라 횡격막과 갈비뼈를 절단하여 심장과 폐를 노출시킵니다.
4. 간, 비장, 장 및 신장을 조심스럽게 제거합니다. 장 벽을 자르지 마십시오.
5. 폐와 식도를 제거하십시오.
6. 한 손에는 집게로 심장을 부드럽게 들어 올리고 다른 한 손에는 수술용 가위로 대동맥과 척추를 분리합니다. 그런 다음 심장과 대동맥을 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 PBS가 있는 60mm 페트리 접시에 담습니다.
7. 알코올에서 미세 수술 겸자와 미세 수술 가위를 제거하고 PBS 25mL로 헹구어 여분의 알코올을 제거합니다. 실체 현미경으로 심장과 대동맥에서 흉선과 기타 조직을 제거한 다음 심장을 제거하고 대동맥에 PVAT를 남깁니다.
8. PVAT가 있는 대동맥을 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PBS가 있는 깨끗한 60mm 페트리 접시에 옮깁니다.
9. 미세수술용 겸자를 사용하여 PVAT를 제거하고, 한 쌍의 겸자는 대동맥을 고정하고 다른 한 쌍은 지방 조직을 잡아당깁니다. 혈관 주위 지방 조직의 손상을 최소화하면서 혈관 조직을 최대한 제거합니다.
10. 흉부 대동맥을 둘러싼 PVAT를 얼음 위에 놓인 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 고포도당 DMEM이 포함된 2mL 미세 원심분리 튜브에 수집합니다.

3. 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리

1. 수집된 조직을 10% v/v 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 PBS와 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 PBS로 순차적으로 헹굽니다.
   참고: 이 단계부터 모든 실험은 클래스 II 층류 후드의 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
2. 조직을 멸균 된 60mm 페트리 접시에 옮기고 200 μL의 분해액을 첨가 한 다음 멸균 가위를 사용하여 1mm³ 조각으로 다집니다.
3. 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 혼합물을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고, 멸균 가위로 절단하여 끝을 넓히고, 6mL의 분해 용액을 추가하여 분해 반응을 시작합니다.
   참고: 1회의 분해 반응(3mL의 분해 용액)은 6마리의 마우스에서 추출한 PVAT 저장소에 충분합니다.
4. 37°C에서 궤도 셰이커(효과적인 혼합을 위한 150rpm 주파수)가 있는 인큐베이터에서 30-45분 동안 조직을 배양합니다. 튜브를 랙에 평평하게 묶어 튜브가 수평으로 흔들리도록 합니다. 10-5분마다 10초 동안 손으로 위아래로 세게 흔듭니다.
   알림: 조직 조각이 남지 않은 상태에서 균질하고 황색을 띤 소화액이 보이면 소화를 중단할 수 있습니다.
5. 70μm 세포 스트레이너를 통해 50mL 원심분리 튜브에 분해된 조직을 걸러냅니다. 세포 스트레이너를 동일한 양의 배양 배지로 헹구어 세포 수율을 최대화하고 소화를 중지합니다.
6. 여과액을 새 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 1,800× g 의 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 펠릿을 5mL의 PBS에 재현탁시킵니다. 1,800 × g 에서 5분 동안 원심분리기
7. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 적절한 양의 배양 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다.
   참고: 6마리의 마우스마다 수집된 세포 펠릿을 1mL의 배양 배지에 재현탁시키고 12웰 플레이트의 웰 1개에 파종합니다.
8. 세포를 콜라겐으로 코팅된 12웰 플레이트에 파종하고 37°C에서 5%_CO2 가 함유된 습한 환경에서 하룻밤 동안 배양합니다.
9. 다음날 배양 배지를 흡인하고 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 예열된(37°C) PBS로 세포를 세척하여 세포 파편과 적혈구를 제거하고 신선한 배양 배지 1mL를 각각 웰에 다시 추가합니다.

4. 대동맥 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 지방형성 유도

1. 세포가 ~60-70% 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배양 배지를 교체합니다.
   참고 : 세포가 3-4 % 합류에 도달하는 데 일반적으로 60-70 일이 걸립니다.
2. 세포가 60-70% 합류에 도달하면 배양 배지를 흡인하고 갈색 지방 유도 배지로 교체합니다. 지방 분화가 유도되는 날을 분화의 0 일로 생각하십시오.
3. 72시간(분화 3일차) 후 유지 배지로 배지를 새로 고칩니다. 세포가 실험에 사용될 때까지 2일마다 유지 배지를 교체합니다.
4. 지방 세포를 Oil Red O 염색(¹⁴ ) 및 웨스턴 블로팅(western blotting)⁽¹⁵)과 같은 적절한 방법으로 분석한다.

결과

위에서 설명한 이 프로토콜을 사용하여 쥐 흉부 대동맥을 둘러싼 PVAT를 조심스럽게 분리했습니다(그림 1A-D). 멸균 가위(그림 1E,F)를 사용하여 PVAT를 세척하고 작은 조각으로 다진 후(그림 1E,F), 조직 단편을 제1형 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 디스파제 II(4mg/mL)를 함유한 소화액에서 분해하고 셰이커에서 37°C에서 30-45분 동안 배양했습니다(

토론

우리는 마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리 및 지방 유도를 위한 실용적이고 실현 가능한 접근 방식을 제안합니다. 이 프로토콜의 장점은 간단하고 경제적이라는 것입니다. 조직이 부족하면 SVF 밀도가 낮아지고 성장 상태가 좋지 않아 궁극적으로 지방 생성 효율에 영향을 미칠 수 있으므로 적절한 수의 마우스가 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 또한 마우스 나이는 SVF?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001