Выделение, культивирование и адипогенная индукция преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши

Резюме

В данной работе мы описываем выделение, культивирование и адипогенную индукцию преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши, что позволяет изучать периваскулярную функцию жировой ткани и ее взаимосвязь с сосудистыми клетками.

Аннотация

Периваскулярная жировая ткань (PVAT) представляет собой депо жировой ткани, которое окружает кровеносные сосуды и проявляет фенотипы белых, бежевых и коричневых адипоцитов. Недавние открытия пролили свет на центральную роль ПВАТ в регуляции сосудистого гомеостаза и участии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Всестороннее понимание свойств и регуляции PVAT имеет большое значение для разработки будущих методов лечения. Первичные культуры периаортальных адипоцитов ценны для изучения функции PVAT и перекрестных помех между периаортальными адипоцитами и сосудистыми клетками. В данной работе представлен экономичный и осуществимый протокол выделения, культивирования и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из периаортальной жировой ткани мыши, который может быть полезен для моделирования адипогенеза или липогенеза in vitro. Протокол описывает обработку тканей и дифференцировку клеток для культивирования периаортальных адипоцитов молодых мышей. Этот протокол станет технологическим краеугольным камнем на стенде для исследования функции PVAT.

Введение

Считается, что периваскулярная жировая ткань (PVAT), периваскулярная структура, состоящая из смеси зрелых адипоцитов и стромально-васкулярной фракции (SVF), взаимодействует со стенкой соседнего сосуда через его секретом паракринально¹. Являясь важнейшим регулятором сосудистого гомеостаза, дисфункция PVAT вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний ^2,3,4. SVF ткани адипоцитов состоит из нескольких ожидаемых клеточных популяций, включая эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки мезотелия, нейрональные клетки, а также стволовые и прогениторные клетки жировой ткани (ASPC)^5,6. Хорошо известно, что ASPC, находящиеся в SVF жировой ткани, могут давать начало зрелым адипоцитам⁵. Предполагается, что SVF является критическим источником зрелых адипоцитов в PVAT. Несколько исследований показали, что PVAT-SVF может дифференцироваться в зрелые адипоциты при определенных условиях индукции ^6,7,8.

В настоящее время существуют две системы выделения SVF из жировой ткани, одна из которых является ферментативным пищеварением, а другая - неферментативной⁹. Ферментативные методы, как правило, приводят к более высокому выходу ядросодержащих клеток-предшественников¹⁰. На сегодняшний день широко продемонстрированы преимущества SVF в стимулировании регенерации сосудов и неоваскуляризации при заживлении ран, урогенитальных и сердечно-сосудистых заболеваниях^11, особенно в дерматологии и пластической хирургии^12,13. Тем не менее, перспективы клинического применения SVF, полученного из PVAT, недостаточно изучены, что может быть связано с отсутствием стандартизированного метода выделения SVF из PVAT. Целью данного протокола является установление стандартизированного подхода к выделению, культивированию и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из SVF-полученных из мышиного ПВАТ, окружающих грудную аорту, что позволит в дальнейшем исследовать функцию ПВАТ. Этот протокол оптимизирует методы обработки тканей и дифференцировки клеток для культивирования периаортальных адипоцитов, полученных от молодых мышей.

протокол

Протоколы содержания животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Шанхайской больнице грудной клетки, связанной с Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тун (номер утверждения: KS23010) и соответствовали соответствующим этическим нормам. Для этого эксперимента следует отдавать предпочтение самцам и самкам мышей C57BL/6 в возрасте 4-8 недель.

1. Подготовка хирургических инструментов, буферов и питательных сред

1. Автоклавные хирургические инструменты (например, хирургические ножницы и стандартные щипцы) при 121 °C в течение 30 мин. Продезинфицировать микрохирургические инструменты 75% спиртом.
2. Приготовьте стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) с добавлением 1% v/v пенициллина-стрептомицина и еще 10 мл PBS с добавлением 10% v/v пенициллина-стрептомицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах, если не указано иное, ПБС относится к обычному стерильному ПБС.
3. Приготовьте буфер Krebs Ringer HEPES BSA: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 20 мМ HEPES, растворенный в растворе Krebs Ringer.
4. Приготовьте свежий раствор для пищеварения: коллагеназу типа 1 (1 мг/мл) и диспазу II (4 мг/мл) растворить в буфере Krebs Ringer HEPES BSA. Простерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
5. Подготовьте 12-луночную пластину, покрытую коллагеном.
   1. Раствор коллагена (1 мг/мл) разбавить стерильной деионизированной водой до концентрации 40 мкг/мл. Добавьте 1 мл разбавленного раствора коллагена на поверхность каждой лунки до достижения концентрации 6-10 мкг/^см2. Выдерживают покрытие в течение 1 ч при комнатной температуре.
   2. Удалите остатки раствора и промойте каждую лунку 2 раза 1 мл PBS. Используйте пластину немедленно или высушите ее на воздухе в ламинарном колпаке класса II и храните пластину с покрытием при температуре 2-8 °C. При хранении пластины с покрытием заклеить парапленкой.
6. Приготовьте питательную среду: модифицированную среду Eagles с высоким содержанием глюкозы Dulbecco (DMEM), 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% v/v пенициллин-стрептомицин. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
7. Приготовьте липогенную индукционную среду: ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% ФБС, 1% в/в пенициллин-стрептомицин, 1 нМ трийодтиронин, 1 мкМ розиглитазон, 1 мкМ инсулина, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) и 1 мкМ дексаметазон. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
8. Приготовьте поддерживающую среду: ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% ФБС, 1% в/в пенициллин-стрептомицин, 1 нМ трийодтиронин, 1 мкМ росиглитазон и 1 мкМ инсулин. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.

2. Рассечение и выделение периваскулярной жировой ткани (PVAT)

1. Усыпляют мышь вывихом шейки матки под 2% анестезией изофлураном или при передозировке углекислого газа. Спрей с 75% спиртом для дезинфекции кожи.
2. Поместите мышь в положение лежа на спине (лицом вверх).
3. Поднимите кожу, сделайте небольшой разрез и тупо отделите кожу и мышцы живота хирургическими ножницами вдоль вентральной средней линии от таза до шеи. Обнажите сердце и легкие, разрезав диафрагму и ребра по обеим сторонам средней линии.
4. Осторожно удалите печень, селезенку, кишечник и почки. Избегайте порезов стенки кишечника.
5. Удалить легкие и пищевод.
6. Аккуратно приподнимите сердце щипцами в одной руке и отделите аорту от позвоночника хирургическими ножницами в другой руке. Затем поместите сердце и аорту в чашку Петри диаметром 60 мм с PBS, содержащей 1% v/v пенициллина-стрептомицина.
7. Снимите микрохирургические щипцы и микрохирургические ножницы со спирта и промойте в 25 мл PBS, чтобы удалить излишки спирта. Под стереомикроскопом удалите тимус и другие ткани из сердца и аорты, затем удалите сердце, оставив аорту с ПВАТ.
8. Перенесите аорту с ПВАТ в чистую чашку Петри диаметром 60 мм с ПБС, содержащей 1%/в пенициллина-стрептомицина.
9. Используйте микрохирургические щипцы для удаления PVAT, при этом одна пара щипцов фиксирует аорту, а другая удаляет жировую ткань. Удалить сосудистую ткань настолько, насколько это возможно, минимизируя повреждение периваскулярной жировой ткани.
10. Соберите PVAT, окружающий грудную аорту, в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую DMEM с высоким содержанием глюкозы, добавленную 1% v/v пенициллина-стрептомицина, помещенную на лед.

3. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF)

1. Собранные ткани последовательно промывают PBS, содержащим 10% v/v пенициллина-стрептомицина, и PBS, содержащим 1% v/v пенициллина-стрептомицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, все эксперименты должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном колпаке класса II.
2. Переложите ткани в стерильную чашку Петри диаметром 60 мм, добавьте 200 мкл раствора для пищеварения и измельчите их стерильными ножницами на кусочки размером^{1 мм3} .
3. Перелейте смесь в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью пластикового наконечника пипетки, конец которого расширен стерильным надрезом ножниц, и добавьте 6 мл раствора для сбраживания, чтобы начать реакцию сбраживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одной реакции сбраживания (3 мл раствора для разложения) достаточно для депо PVAT от шести мышей.
4. Инкубируют ткани при 37 °C в инкубаторе с орбитальным шейкером (частота 150 об/мин для эффективного перемешивания) в течение 30-45 мин. Привяжите трубки к решетке, чтобы трубки тряслись горизонтально. Энергично встряхивайте вверх и вниз рукой в течение 10 секунд каждые 5-10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пищеварение может быть прекращено, когда видна однородная желтоватая пищеварительная жидкость без остатков фрагментов ткани.
5. Процедите переваренные ткани через ситечко с ячейками 70 мкм в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Промойте клеточное ситечко равным объемом питательной среды, чтобы максимизировать выход клеток и остановить пищеварение.
6. Переложите фильтрат в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при концентрации 1 800 × г в течение 10 мин. Переверните пробирку, чтобы удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулы в 5 мл PBS. Центрифуга при 1 800 × г в течение 5 мин.
7. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пробирку, и повторно суспендируйте гранулы в соответствующем объеме питательной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы, собранные у каждых шести мышей, ресуспендируют в 1 мл питательной среды и высевают в одну лунку 12-луночного планшета.
8. Высейте клетки в покрытую коллагеном 12-луночную планшет и инкубируйте при 37 °C во влажной атмосфере с 5%_CO2 в течение ночи.
9. На следующий день аспирируют питательную среду, промывают клетки предварительно подогретым (37 °C) PBS, содержащим 1% v/v пенициллина-стрептомицина, для удаления клеточного мусора и эритроцитов, и добавляют обратно по 1 мл свежей питательной среды в каждую лунку.

4. Адипогенная индукция SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани

1. Меняйте питательную среду через день, пока клетки не достигнут слияния ~60-70%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется 3-4 дня, чтобы ячейки достигли 60-70% слияния.
2. Когда клетки достигнут 60-70% слияния, аспирируют питательную среду и заменяют ее коричневой адипогенной индукционной средой. День индукции адипогенной дифференцировки считать днем 0 дифференцировки.
3. Через 72 ч (3-й день дифференциации) освежите среду поддерживающей средой. Меняйте поддерживающую среду каждые 2 дня до тех пор, пока клетки не будут использованы для экспериментов.
4. Проанализируйте адипогенные клетки соответствующим образом, например, окрашивая масляно-красным O¹⁴ и вестерн-блоттингом¹⁵.

Результаты

Используя этот протокол, описанный выше, мы тщательно изолировали PVAT, окружающие грудные аорты мышей (рис. 1A-D). После промывки и измельчения ПВАТ на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц (рис. 1E, F) фрагменты тканей переваривали в растворе д...

Обсуждение

Предложен практический и осуществимый подход к выделению и адипогенной индукции SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани мыши. Преимущества этого протокола в том, что он прост и экономичен. Достаточное количество мышей имеет решающее значение для успешной изоляции...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001