Выделение, культивирование и адипогенная индукция преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши

Резюме

В данной работе мы описываем выделение, культивирование и адипогенную индукцию преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши, что позволяет изучать периваскулярную функцию жировой ткани и ее взаимосвязь с сосудистыми клетками.

Аннотация

Периваскулярная жировая ткань (PVAT) представляет собой депо жировой ткани, которое окружает кровеносные сосуды и проявляет фенотипы белых, бежевых и коричневых адипоцитов. Недавние открытия пролили свет на центральную роль ПВАТ в регуляции сосудистого гомеостаза и участии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Всестороннее понимание свойств и регуляции PVAT имеет большое значение для разработки будущих методов лечения. Первичные культуры периаортальных адипоцитов ценны для изучения функции PVAT и перекрестных помех между периаортальными адипоцитами и сосудистыми клетками. В данной работе представлен экономичный и осуществимый протокол выделения, культивирования и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из периаортальной жировой ткани мыши, который может быть полезен для моделирования адипогенеза или липогенеза in vitro. Протокол описывает обработку тканей и дифференцировку клеток для культивирования периаортальных адипоцитов молодых мышей. Этот протокол станет технологическим краеугольным камнем на стенде для исследования функции PVAT.

Введение

Считается, что периваскулярная жировая ткань (PVAT), периваскулярная структура, состоящая из смеси зрелых адипоцитов и стромально-васкулярной фракции (SVF), взаимодействует со стенкой соседнего сосуда через его секретом паракринально¹. Являясь важнейшим регулятором сосудистого гомеостаза, дисфункция PVAT вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний ^2,3,4. SVF ткани адипоцитов состоит из нескольких ожидаемых клеточных популяций, включая эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки мезотелия, нейрональные клетки, а также стволовые и прогенитор....

протокол

Протоколы содержания животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Шанхайской больнице грудной клетки, связанной с Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тун (номер утверждения: KS23010) и соответствовали соответствующим этическим нормам. Для этого эксперимента следует отдавать предпочтение самцам и самкам мышей C57BL/6 в возрасте 4-8 недель.

1. Подготовка хирургических инструментов, буферов и питательных сред

1. Автоклавные хирургические инструменты (например, хирургические ножницы и стандартные щипцы) при 121 °C в течение 30 мин. Продезинфицировать микрохирургические инструме....

Результаты

Используя этот протокол, описанный выше, мы тщательно изолировали PVAT, окружающие грудные аорты мышей (рис. 1A-D). После промывки и измельчения ПВАТ на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц (рис. 1E, F) фрагменты тканей переваривали в растворе д.......

Обсуждение

Предложен практический и осуществимый подход к выделению и адипогенной индукции SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани мыши. Преимущества этого протокола в том, что он прост и экономичен. Достаточное количество мышей имеет решающее значение для успешной изоляции.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001