Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Resumen

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Resumen

El tejido adiposo perivascular (PVAT) es un depósito de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos y exhibe los fenotipos de los adipocitos blancos, beige y marrones. Descubrimientos recientes han arrojado luz sobre el papel central de la PVAT en la regulación de la homeostasis vascular y en la participación en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. Una comprensión integral de las propiedades y la regulación de PVAT es de gran importancia para el desarrollo de futuras terapias. Los cultivos primarios de adipocitos periaórticos son valiosos para estudiar la función de PVAT y la diafonía entre los adipocitos periaórticos y las células vasculares. En este trabajo se presenta un protocolo económico y factible para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, que puede ser útil para modelar la adipogénesis o lipogénesis in vitro. El protocolo describe el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos de ratones jóvenes. Este protocolo proporcionará la piedra angular tecnológica en el banco para la investigación de la función de PVAT.

Introducción

Se cree que el tejido adiposo perivascular (PVAT), una estructura perivascular compuesta por una mezcla de adipocitos maduros y una fracción vascular estromal (SVF), interactúa con la pared del vaso adyacente a través de su secretoma paracrino¹. Como regulador crítico de la homeostasis vascular, la disfunción de PVAT está implicada en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares ^2,3,4. La SVF del tejido adipocito está formada por varias poblaciones celulares esperadas, entre las que se incluyen las células endoteliales, las células inmunitarias, las células mesoteliales, las células neuronales y las células madre y progenitoras adiposas (ASPC)^5,6. Es bien sabido que las ASPC que residen en la SVF del tejido adiposo pueden dar lugar a adipocitos maduros⁵. Se infiere que la SVF es una fuente crítica de adipocitos maduros en PVAT. Varios estudios han demostrado que el PVAT-SVF puede diferenciarse en adipocitos maduros en condiciones específicas de inducción ^6,7,8.

Actualmente, existen dos sistemas de aislamiento para aislar la SVF del tejido adiposo, uno es la digestión enzimática y el otro es no enzimático⁹. Los métodos enzimáticos suelen dar lugar a un mayor rendimiento de células progenitoras nucleadas¹⁰. Hasta la fecha, los beneficios de la SVF en la promoción de la regeneración vascular y la neovascularización en la cicatrización de heridas, enfermedades urogenitales y cardiovasculares han sido ampliamente demostrados¹¹, especialmente en dermatología y cirugía plástica^12,13. Sin embargo, las perspectivas de aplicación clínica de la SVF derivada de PVAT no han sido bien exploradas, lo que puede atribuirse a la falta de un método estandarizado para el aislamiento de SVF de PVAT. El objetivo de este protocolo es establecer un enfoque estandarizado para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVSP a partir de la PVAT de ratón que rodea la aorta torácica, lo que permite una mayor investigación de la función de la PVAT. Este protocolo optimiza el procesamiento de tejidos y las técnicas de diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos obtenidos de ratones jóvenes.

Protocolo

Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital del Tórax de Shanghái, afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (número de aprobación: KS23010) y cumplían con las normas éticas pertinentes. Para este experimento se prefieren ratones machos y hembras C57BL/6 de 4 a 8 semanas de edad.

1. Preparación de herramientas quirúrgicas, tampones y medios de cultivo

1. Herramientas quirúrgicas de autoclave (p. ej., tijeras quirúrgicas y pinzas estándar) a 121 °C durante 30 min. Desinfectar el instrumental microquirúrgico con alcohol al 75%.
2. Prepare solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 1% v/v y otros 10 ml de PBS suplementados con penicilina-estreptomicina v/v al 10%.
   NOTA: En las siguientes secciones, si no se menciona específicamente, PBS se refiere a PBS estéril regular.
3. Prepare el tampón Krebs Ringer HEPES BSA: 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 20 mM HEPES disueltos en la solución Krebs Ringer.
4. Preparar solución de digestión fresca: colagenasa tipo 1 (1 mg/mL) y dispasa II (4 mg/mL) disueltas en tampón Krebs Ringer HEPES BSA. Esterilice la solución con un filtro de 0,2 μm.
5. Prepare un plato de 12 pocillos recubierto de colágeno.
   1. Diluir la solución de colágeno (1 mg/mL) con agua desionizada estéril hasta una concentración de 40 μg/mL. Añadir 1 mL de la solución de colágeno diluido en la superficie de cada pocillo para conseguir una concentración de 6-10 μg/^cm2. Incubar el recubrimiento durante 1 h a temperatura ambiente.
   2. Retire la solución restante y enjuague cada pocillo 2 veces con 1 ml de PBS. Utilice la placa inmediatamente o séquela al aire en una campana de flujo laminar de clase II y almacene la placa recubierta a 2-8 °C. Al almacenar, selle las placas recubiertas con parafilm.
6. Prepare el medio de cultivo: medio Dulbecco-Modified Eagles (DMEM) con alto contenido de glucosa, suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% v/v. Mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
7. Prepare el medio de inducción lipogénico: DMEM con alto contenido de glucosa, 10 % de FBS, 1 % v/v de penicilina-estreptomicina, 1 nM de triyodotironina, 1 μM de rosiglitazona, 1 μM de insulina, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y 1 μM de dexametasona. Mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
8. Prepare el medio de mantenimiento: DMEM con alto contenido de glucosa, 10 % de FBS, 1 % v/v de penicilina-estreptomicina, 1 nM de triyodotironina, 1 μM de rosiglitazona y 1 μM de insulina. Mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.

2. Disección y aislamiento del tejido adiposo perivascular (PVAT)

1. Eutanasia del ratón por luxación cervical bajo anestesia con isoflurano al 2% o con sobredosis de dióxido de carbono. Pulverizar con alcohol al 75% para la desinfección de la piel.
2. Coloque el ratón en posición supina (mirando hacia arriba).
3. Levante la piel, haga una pequeña incisión y separe sin rodeos la piel y los músculos abdominales con unas tijeras quirúrgicas a lo largo de la línea media ventral desde la pelvis hasta el cuello. Exponga el corazón y los pulmones cortando el diafragma y las costillas a lo largo de ambos lados de la línea media.
4. Extirpe con cuidado el hígado, el bazo, los intestinos y el riñón. Evite cortar la pared intestinal.
5. Extirpar los pulmones y el esófago.
6. Levante suavemente el corazón con fórceps en una mano y separe la aorta de la columna vertebral con unas tijeras quirúrgicas en la otra mano. Luego, coloque el corazón y la aorta en una placa de Petri de 60 mm con PBS que contenga 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
7. Retire las pinzas microquirúrgicas y las tijeras microquirúrgicas del alcohol y enjuague con 25 ml de PBS para eliminar el exceso de alcohol. Bajo un microscopio estereoscópico, extirpe el timo y otros tejidos del corazón y la aorta, luego extirpe el corazón, dejando la aorta con los PVAT.
8. Transfiera la aorta con los PVAT a una placa de Petri limpia de 60 mm con PBS que contenga penicilina-estreptomicina al 1% v/v.
9. Use pinzas microquirúrgicas para extirpar los PVAT, con un par de pinzas fijando la aorta y el otro tirando del tejido adiposo. Extirpar el tejido de la vasculatura tanto como sea posible mientras se minimiza el daño al tejido adiposo perivascular.
10. Recoja el PVAT que rodea la aorta torácica en el tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con penicilina-estreptomicina al 1% v/v colocado en hielo.

3. Aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF)

1. Enjuague los tejidos recolectados secuencialmente con PBS que contenga 10% v/v de penicilina-estreptomicina y PBS que contenga 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
   NOTA: A partir de este paso, todos los experimentos deben llevarse a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar de clase II.
2. Transfiera los tejidos a una placa de Petri estéril de 60 mm, agregue 200 μL de solución de digestión y píquelos en^{trozos de 1 mm 3} con unas tijeras estériles.
3. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga de 15 ml con una punta de pipeta de plástico, el extremo ensanchado por un corte de tijera estéril, y agregue 6 ml de solución de digestión para iniciar la reacción de digestión.
   NOTA: Una reacción de digestión (3 ml de solución de digestión) es suficiente para los depósitos de PVAT de seis ratones.
4. Incubar los tejidos a 37 °C en una incubadora con agitador orbital (frecuencia de 150 rpm para una mezcla eficaz) durante 30-45 min. Ata los tubos en una rejilla para que se agiten horizontalmente. Agitar vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con la mano durante 10 s cada 5-10 min.
   NOTA: La digestión se puede interrumpir cuando se observa un líquido digestivo homogéneo y amarillento sin fragmentos de tejido.
5. Cuele los tejidos digeridos a través de un colador celular de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 ml. Enjuague el filtro celular con un volumen igual de medio de cultivo para maximizar el rendimiento celular y detener la digestión.
6. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 1.800 × g durante 10 minutos. Invierta el tubo para desechar el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 5 mL de PBS. Centrifugar a 1.800 × g durante 5 min.
7. Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender los gránulos en un volumen adecuado de medio de cultivo.
   NOTA: Los gránulos celulares recolectados de cada seis ratones se resuspenden en 1 ml de medio de cultivo y se siembran en un pocillo de una placa de 12 pocillos.
8. Siembre las células en una placa de 12 pocillos recubierta de colágeno e incube a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de_CO2 durante la noche.
9. Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo, lavar las células con PBS precalentado (37 °C) que contenga penicilina-estreptomicina al 1% v/v para eliminar los restos celulares y los glóbulos rojos, y volver a agregar 1 ml de medio de cultivo fresco en cada pocillo.

4. Inducción adipogénica de preadipocitos derivados de SVF a partir de tejido adiposo periaórtico

1. Cambie el medio de cultivo cada dos días hasta que las células alcancen ~60-70% de confluencia.
   NOTA: Por lo general, las células tardan entre 3 y 4 días en alcanzar el 60-70% de confluencia.
2. Cuando las células alcancen el 60-70% de confluencia, aspire el medio de cultivo y reemplácelo con un medio de inducción adipogénico marrón. Considere el día de inducción de la diferenciación adipogénica como el día 0 de la diferenciación.
3. Después de 72 h (día 3 de diferenciación), refresque el medio con medio de mantenimiento. Cambie el medio de mantenimiento cada 2 días hasta que las células se utilicen para experimentos.
4. Analice las células adipogénicas de manera adecuada, como la tinción Oil Red O¹⁴ y la Western blot¹⁵.

Resultados

Utilizando este protocolo descrito anteriormente, aislamos cuidadosamente las PVAT que rodean las aortas torácicas de ratón (Figura 1A-D). Después de lavar y picar los PVAT en trozos pequeños con unas tijeras estériles (Figura 1E, F), los fragmentos de tejido se digirieron en una solución de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (1 mg/mL) y dispasa II (4 mg/mL) y se incubaron a 37 °C en un agitador d...

Discusión

Proponemos un enfoque práctico y factible para el aislamiento y la inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVS a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón. Las ventajas de este protocolo son que es sencillo y económico. Un número adecuado de ratones es fundamental para un aislamiento exitoso, ya que un tejido insuficiente puede dar lugar a una baja densidad de SVF y a un mal estado de crecimiento, lo que en última instancia afecta a la eficiencia lipogénica. Además, la edad del ratón es un f...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001