Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Resumen

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Resumen

El tejido adiposo perivascular (PVAT) es un depósito de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos y exhibe los fenotipos de los adipocitos blancos, beige y marrones. Descubrimientos recientes han arrojado luz sobre el papel central de la PVAT en la regulación de la homeostasis vascular y en la participación en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. Una comprensión integral de las propiedades y la regulación de PVAT es de gran importancia para el desarrollo de futuras terapias. Los cultivos primarios de adipocitos periaórticos son valiosos para estudiar la función de PVAT y la diafonía entre los adipocitos periaórticos y las células vasculares. En este trabajo se presenta un protocolo económico y factible para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, que puede ser útil para modelar la adipogénesis o lipogénesis in vitro. El protocolo describe el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos de ratones jóvenes. Este protocolo proporcionará la piedra angular tecnológica en el banco para la investigación de la función de PVAT.

Introducción

Se cree que el tejido adiposo perivascular (PVAT), una estructura perivascular compuesta por una mezcla de adipocitos maduros y una fracción vascular estromal (SVF), interactúa con la pared del vaso adyacente a través de su secretoma paracrino¹. Como regulador crítico de la homeostasis vascular, la disfunción de PVAT está implicada en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares ^2,3,4. La SVF del tejido adipocito está formada por varias poblaciones celulares esperadas, entre las que se incluyen las células endoteliales, las células inmunitarias,....

Protocolo

Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital del Tórax de Shanghái, afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (número de aprobación: KS23010) y cumplían con las normas éticas pertinentes. Para este experimento se prefieren ratones machos y hembras C57BL/6 de 4 a 8 semanas de edad.

1. Preparación de herramientas quirúrgicas, tampones y medios de cultivo

1. Herramientas quirúrgicas de autoclave (p. ej., tijeras quirúrgicas y pinzas estándar) a 121 °C durante 30 min. Desinfectar el instrumental microquirúrgico con alco....

Discusión

Proponemos un enfoque práctico y factible para el aislamiento y la inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVS a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón. Las ventajas de este protocolo son que es sencillo y económico. Un número adecuado de ratones es fundamental para un aislamiento exitoso, ya que un tejido insuficiente puede dar lugar a una baja densidad de SVF y a un mal estado de crecimiento, lo que en última instancia afecta a la eficiencia lipogénica. Además, la edad del ratón es un f.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001