マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

要約

本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。

要約

血管周囲脂肪組織(PVAT)は、血管を取り囲み、白色、ベージュ色、茶色の脂肪細胞の表現型を示す脂肪組織デポです。最近の発見により、血管の恒常性を調節し、心血管疾患の病因に関与するPVATの中心的な役割が明らかになりました。PVATの特性と調節を包括的に理解することは、将来の治療法の開発にとって非常に重要です。大動脈周囲脂肪細胞の初代培養は、PVAT機能や大動脈周囲脂肪細胞と血管細胞間のクロストークを研究する上で貴重です。この論文は、in vitroでの脂肪形成または脂肪形成のモデル化に有用であり得る、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管画分由来前駆脂肪細胞の単離、培養、および脂肪生成誘導のための経済的で実行可能なプロトコルを提示します。プロトコルは若いマウスからのperiaortic脂肪細胞を培養するためのティッシュ処理そしてセル微分を概説する。このプロトコルは、PVAT機能を調査するためのベンチサイドの技術的基盤を提供します。

概要

成熟脂肪細胞と間質血管分画(SVF)の混合物からなる血管周囲構造である血管周囲脂肪組織(PVAT)は、その分泌傍を介して隣接する血管壁と相互作用すると考えられています¹。血管の恒常性を調節する重要な調節因子として、PVATの機能不全は心血管疾患の病因に関与しています^2,3,4。脂肪細胞組織のSVFは、内皮細胞、免疫細胞、中皮細胞、神経細胞、脂肪幹細胞および前駆細胞(ASPC)など、いくつかの予想される細胞集団で構成されています^5,6。脂肪組織のSVFに常在するASPCが成熟脂肪細胞を生じさせることはよく知られている⁵。SVFは、PVATにおける成熟脂肪細胞の重要な供給源であると推測されています。いくつかの研究により、PVAT-SVFは特定の誘導条件下で成熟脂肪細胞に分化できることが示されています^6,7,8。

プロトコル

動物プロトコルは、上海交通大学医学部附属上海胸部病院の動物実験委員会(承認番号:KS23010)によって承認され、関連する倫理規制に準拠していました。この実験では、4〜8週齢の雄および雌のC57BL / 6マウスが優先されます。

1. 手術器具、緩衝液、培地の調製

1. オートクレーブ手術器具(手術用ハサミや標準鉗子など)を121°Cで30分間。マイクロサージェリー器具を75%アルコールで消毒します。
2. 1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と、10% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した別の 10 mL の PBS を調製します。
   注:以下のセクションでは、特に言及されていない場合、PBSは通常の滅菌PBSを指します。
3. Krebs Ringer HEPES BSAバッファーを調製します:1%ウシ血清アルブミン(BSA)、20 mM HEPESをKrebs Ringer溶液に溶解します。
4. Krebs Ringer HEPES BSAバッファーに溶解した1型コラゲナーゼ(1 mg/mL)およびディスパーゼII(4 mg/mL)の新鮮な消化液を調製します。0.2μmのフィルターで溶液を滅菌します。
5. コラーゲンでコーティングされた12ウェルプレートを調製します。
   1. コラーゲン溶液....

ディスカッション

本研究では、マウス大動脈周囲脂肪組織からSVF由来前駆脂肪細胞を単離し、脂肪誘発するための実用的かつ実行可能なアプローチを提案する。このプロトコルの利点は、シンプルで経済的であることです。組織が不十分な場合、SVF密度が低くなり、増殖状態が悪くなり、最終的に脂肪生成効率に影響を与える可能性があるため、十分な数のマウスが単離を成功させるために重要です。さらに?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001