فحص نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية

Summary

هنا نصف مقايسة نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية في المنزل. تم استخدام المقايسات القائمة على النشاط والمقايسات القائمة على المستضد لقياس عامل الأنسجة في الحويصلات خارج الخلية من عينات البلازما البشرية. المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد.

Abstract

عامل الأنسجة (TF) هو مستقبل عبر الغشاء للعامل (F) VII و FVIIa. يبدأ مجمع TF / FVIIa سلسلة التخثر عن طريق تنشيط كل من FIX و FX. يتم إطلاق TF من الخلايا إلى الدورة الدموية في شكل حويصلات خارج الخلية (EVs). يزداد مستوى EVs الإيجابية (⁺) في أمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والالتهابات البكتيرية والفيروسية وتليف الكبد ، ويرتبط بالتخثر والتخثر المنتشر داخل الأوعية وشدة المرض والوفيات. هناك طريقتان لقياس TF ⁺ EVs في البلازما: المقايسات القائمة على المستضد والنشاط. تشير البيانات إلى أن المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد. تصف هذه الورقة مقايسة نشاط EVTF الداخلية الخاصة بنا بناء على فحص جيل FXa على مرحلتين. تتم إضافة FVIIa و FX والكالسيوم إلى العينات المحتوية على TF ⁺ EV لتوليد FXa في وجود وغياب الأجسام المضادة المضادة ل TF لتمييز جيل FXa المعتمد على TF عن جيل FXa المستقل عن TF. يتم استخدام ركيزة كروموجينية مشقوقة بواسطة FXa لتحديد مستوى FXa ، بينما يتم استخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام TF المؤتلف المعاد تدبيره لتحديد تركيز TF. يتميز اختبار نشاط EVTF الداخلي هذا بحساسية وخصوصية أعلى من مقايسة نشاط TF التجاري.

Introduction

يبدأ تخثر الدم بربط العامل (F) VII / VIIa بعامل الأنسجة (TF) ¹. ينشط مركب TF / FVIIa كلا من FIX و FX لتنشيط تخثر الدم¹. هناك نوعان من TF كامل الطول المرتبط بالغشاء: مشفر ونشط. بالإضافة إلى ذلك ، هناك شكل مقسم بدلا من TF (asTF). يحافظ Sphingomyelin و phosphatidylcholine في النشرة الخارجية لغشاء الخلية على TF في حالة مشفرة^2،3،4. عندما يتم تنشيط الخلايا أو تلفها ، ينقل الفوسفوليبيد سكرامبلاز الفوسفاتيديل سيرين وغيره من الدهون الفوسفاتية سالبة الشحنة إلى النشرة الخارجية¹. يؤدي تنشيط الخلايا أيضا إلى نقل حمض ا....

Protocol

تمت الموافقة على البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل (رقم البروتوكول: 14-2108).

1. جمع الدم من المتبرعين

1. جمع الدم الكامل باستخدام بزل الوريد النظيف في الوريد قبل المرفقي بإبرة 21 جرام. تخلص من أول 3 مل من الدم لأن هذا الجزء من الدم قد يحتوي على TF من الخلايا المحيطة بالأوعية.
2. اسحب 2.7 أو 1.8 مل (حسب حجم الأنابيب) من الدم إلى مفرغ يحتوي على 3.2٪ سترات الصوديوم (0.109 مول / لتر). لا تفرط في ملء الأنابيب أو تنقصها. اقلب الأنابيب برفق مباشرة بعد جمع الدم لتفريق سترات الصوديوم.
3. تجنب الهياج إذا تم نقل الأنابيب قبل المعالجة. تحضير البلازما في غضون 2 ساعة من جمع الدم.<....

النتائج

تعطي النتيجة الناجحة قيمة تحكم إيجابية تبلغ ≥0.5 بيكوغرام / مل وقيمة تحكم سلبية تبلغ <0.5 بيكوغرام / مل. من الأفضل العثور على مستجيب LPS مرتفع مع نشاط EVTF >1.0 بيكوغرام / مل للتحكم الإيجابي. تظهر النتيجة التمثيلية نشاط EVTF للمركبات الكهربائية المعزولة من البلازما من الدم الكامل ل 11 متبرعا صحيا ، مع أ.......

Discussion

هنا ، يتم تقديم بروتوكول فحص نشاط EVTF الداخلي الخاص بنا. هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول. عند إعادة تكوين حبيبات EV, من المهم أن تكون ماصة لأعلى ولأسفل في موقع حبيبات EV حتى لو لم تكن مرئية. ستؤدي إعادة التكوين غير الكاملة لحبيبات EV إلى سلبية خاطئة أو تقليل تقدير قيم نشاط EVTF للعينات. ثانيا ، .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55