Saggio di attività del fattore tissutale delle vescicole extracellulari

Riepilogo

Qui descriviamo un test interno di attività del fattore tissutale del tessuto delle vescicole extracellulari. I saggi basati sull'attività e i saggi basati sull'antigene sono stati utilizzati per misurare il fattore tissutale nelle vescicole extracellulari da campioni di plasma umano. I test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene.

Abstract

Il fattore tissutale (TF) è un recettore transmembrana per il fattore (F) VII e FVIIa. Il complesso TF/FVIIa avvia la cascata della coagulazione attivando sia FIX che FX. Il TF viene rilasciato dalle cellule nella circolazione sotto forma di vescicole extracellulari (EV). Il livello di vescicole extracellulari TF-positive (⁺) è aumentato in varie malattie, tra cui il cancro, le infezioni batteriche e virali e la cirrosi, ed è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità. Esistono due modi per misurare le vescicole extracellulari TF⁺ nel plasma: saggi basati sull'antigene e sull'attività. I dati indicano che i test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene. Questo documento descrive il nostro saggio interno dell'attività EVTF basato su un saggio di generazione FXa a due stadi. FVIIa, FX e calcio vengono aggiunti ai campioni contenenti EV ^TF+ per generare FXa in presenza e assenza di anticorpi anti-TF per distinguere la generazione FXa TF-dipendente dalla generazione FXa TF-indipendente. Per determinare il livello di FXa viene utilizzato un substrato cromogenico scisso da FXa, mentre per la determinazione della concentrazione di TF viene utilizzata una curva standard generata con un TF ricombinante relipidato. Questo test di attività EVTF interno ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività TF commerciale.

Introduzione

La coagulazione del sangue inizia con il legame del fattore (F) VII/VIIa al fattore tissutale (TF)¹. Il complesso TF/FVIIa attiva sia FIX che FX per attivare la coagulazione del sangue¹. Esistono due forme di TF full-length, legate alla membrana: crittografato e attivo. Inoltre, esiste una forma alternativa di TF (asTF). La sfingomielina e la fosfatidilcolina nel lembo esterno della membrana cellulare mantengono il TF in uno stato crittografato ^2,3,4. Quando le cellule sono attivate o danneggiate, la scramblasi fosfolipidica tra....

Protocollo

La ricerca è stata approvata dall'Institutional Review Board dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (numero di protocollo: 14-2108).

1. Prelievo di sangue da donatori

1. Prelevare il sangue intero con una venopuntura pulita nella vena antecubitale con un ago da 21 G. Scartare i primi 3 ml di sangue perché questa porzione di sangue può contenere TF da cellule perivascolari.
2. Prelevare 2,7 o 1,8 mL (a seconda delle dimensioni delle provette) di sangue in un vacutainer contenente citrato di sodio al 3,2% (0,109 mol/L). Non riempire eccessivamente o troppo poco i tubi. Capovolgere delicatamente le....

Discussione

Qui viene presentato il protocollo del nostro test interno di attività EVTF. Il protocollo prevede tre passaggi critici. Quando si ricostituisce il pellet EV, è importante pipettare su e giù nella posizione del pellet EV anche se non è visibile. La ricostituzione incompleta del pellet EV comporterà un falso negativo o una sottostima dei valori di attività EVTF dei campioni. In secondo luogo, l'utilizzo di HBSA-Ca(+) è fondamentale nella fase 6.5 del protocollo perché la generazione di FXa non può essere generata.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55