Saggio di attività del fattore tissutale delle vescicole extracellulari

Riepilogo

Qui descriviamo un test interno di attività del fattore tissutale del tessuto delle vescicole extracellulari. I saggi basati sull'attività e i saggi basati sull'antigene sono stati utilizzati per misurare il fattore tissutale nelle vescicole extracellulari da campioni di plasma umano. I test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene.

Abstract

Il fattore tissutale (TF) è un recettore transmembrana per il fattore (F) VII e FVIIa. Il complesso TF/FVIIa avvia la cascata della coagulazione attivando sia FIX che FX. Il TF viene rilasciato dalle cellule nella circolazione sotto forma di vescicole extracellulari (EV). Il livello di vescicole extracellulari TF-positive (⁺) è aumentato in varie malattie, tra cui il cancro, le infezioni batteriche e virali e la cirrosi, ed è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità. Esistono due modi per misurare le vescicole extracellulari TF⁺ nel plasma: saggi basati sull'antigene e sull'attività. I dati indicano che i test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene. Questo documento descrive il nostro saggio interno dell'attività EVTF basato su un saggio di generazione FXa a due stadi. FVIIa, FX e calcio vengono aggiunti ai campioni contenenti EV ^TF+ per generare FXa in presenza e assenza di anticorpi anti-TF per distinguere la generazione FXa TF-dipendente dalla generazione FXa TF-indipendente. Per determinare il livello di FXa viene utilizzato un substrato cromogenico scisso da FXa, mentre per la determinazione della concentrazione di TF viene utilizzata una curva standard generata con un TF ricombinante relipidato. Questo test di attività EVTF interno ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività TF commerciale.

Introduzione

La coagulazione del sangue inizia con il legame del fattore (F) VII/VIIa al fattore tissutale (TF)¹. Il complesso TF/FVIIa attiva sia FIX che FX per attivare la coagulazione del sangue¹. Esistono due forme di TF full-length, legate alla membrana: crittografato e attivo. Inoltre, esiste una forma alternativa di TF (asTF). La sfingomielina e la fosfatidilcolina nel lembo esterno della membrana cellulare mantengono il TF in uno stato crittografato ^2,3,4. Quando le cellule sono attivate o danneggiate, la scramblasi fosfolipidica trasferisce la fosfatidilserina e altri fosfolipidi caricati negativamente al foglietto esterno¹. L'attivazione delle cellule provoca anche la traslocazione della sfingomielinasi acida nel foglietto esterno dove degrada la sfingomielina in ceramide⁵. Questi due meccanismi convertono TF crittografato nel formato attivo. Si propone inoltre che la proteina disolfuro isomerasi medierà la formazione di legami disolfuro tra Cys186 e Cys209 in TF crittografato, che si traduce nella decodifica di TF ^6,7,8. asTF è presente anche in circolo ma manca del dominio transmembrana ed è quindi solubile ^9,10. È importante sottolineare che l'asTF ha livelli molto bassi di attività procoagulante rispetto al TF^{attivo 10,11} a tutta lunghezza.

Le vescicole extracellulari (EV) vengono rilasciate dalle cellule ospiti a riposo, attivate e morenti, nonché dalle cellule tumorali¹². Le vescicole extracellulari esprimono proteine dalle loro cellule parentali¹². Le vescicole extracellulari attive portatrici di TF vengono rilasciate dai monociti attivati, dalle cellule endoteliali e dalle cellule tumorali nella circolazione 13,14,15. I livelli di TF nel plasma possono essere misurati mediante saggi basati sull'attività e sull'antigene. I saggi basati sull'antigene includono l'ELISA e la citometria a flusso¹⁶. Esistono due diversi saggi basati sull'attività: saggi di attività TF a uno e due stadi. Il test a una fase si basa su un test di coagulazione basato sul plasma. Il campione contenente TF viene aggiunto al plasma e viene misurato il tempo necessario per formare un coagulo dopo la ricalcificazione. Il test a due stadi misura la generazione FXa dei campioni aggiungendo FVII o FVIIa, FX e calcio. I livelli di FXa sono determinati utilizzando un substrato che viene scisso da FXa.

Sia nei saggi di attività TF a uno che a due stadi, la concentrazione di TF viene determinata utilizzando una curva standard generata con TF ricombinante. I saggi a due stadi hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai saggi a uno stadio. Molti studi hanno confermato che i saggi basati sull'attività hanno una maggiore sensibilità e specificità rispetto ai saggi basati sull'antigene 17,18,19,20,21. Inoltre, il nostro test di attività in-house ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività commerciale²². Gli individui sani hanno livelli molto bassi o non rilevabili di attività EVTF nel plasma. Al contrario, gli individui con condizioni patologiche, come cancro, cirrosi, sepsi e infezione virale, hanno livelli rilevabili di attività EVTF e questo è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità 23,24,25,26,27,28. Qui, descriveremo questo test interno di attività EVTF a due stadi.

Protocollo

La ricerca è stata approvata dall'Institutional Review Board dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (numero di protocollo: 14-2108).

1. Prelievo di sangue da donatori

1. Prelevare il sangue intero con una venopuntura pulita nella vena antecubitale con un ago da 21 G. Scartare i primi 3 ml di sangue perché questa porzione di sangue può contenere TF da cellule perivascolari.
2. Prelevare 2,7 o 1,8 mL (a seconda delle dimensioni delle provette) di sangue in un vacutainer contenente citrato di sodio al 3,2% (0,109 mol/L). Non riempire eccessivamente o troppo poco i tubi. Capovolgere delicatamente le provette subito dopo il prelievo di sangue per disperdere il citrato di sodio.
3. Evitare l'agitazione se i tubi vengono trasportati prima della lavorazione. Preparare il plasma entro 2 ore dal prelievo di sangue.

2. Preparazione del plasma di controllo negativo

NOTA: I campioni non devono mai essere posti sul ghiaccio prima del congelamento finale.

1. Preparare il plasma di controllo negativo utilizzando sangue intero di volontari sani. Subito dopo il prelievo di sangue, preparare il plasma privo di piastrine come segue.
   1. Trasferire i campioni di sangue dalle provette vacutainer alle provette da 15 ml.
   2. Centrifugare i campioni di sangue a 2.500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente (20-24 °C) senza freno.
   3. Trasferire il surnatante (plasma povero di piastrine) in una nuova provetta e ripetere la rotazione nelle stesse condizioni.
   4. Trasferire il surnatante (plasma depleto di piastrine) in una nuova provetta.
   5. Aliquotare il campione in aliquote da ≥100 μL. Lasciare circa 100 μL sul fondo della provetta.
   6. Congelare immediatamente il plasma impoverito di piastrine a -80 °C (Figura 1).

3. Preparazione del plasma di controllo positivo

NOTA: La risposta al lipopolisaccaride è variabile tra gli individui.

1. Trasferire i campioni di sangue dai vacutainer alle provette da 15 ml.
2. Preparare il plasma di controllo positivo utilizzando sangue intero di volontari sani stimolati con lipopolisaccaride (LPS) da Escherichia coli O111:B4 (10 μg/mL) per 5 ore a 37 °C con agitazione.
3. Dopo 5 ore di incubazione, seguire i passaggi da 2.1.2 a 2.1.6.

4. Isolamento di vescicole extracellulari dal plasma

NOTA: I pellet EV potrebbero non essere visibili. Il tempo di scongelamento dipende dal volume del campione, ma di solito scongeliamo plasma da 100 μL per 30 minuti a 37 °C.

1. Scongelare i campioni di plasma a 37 °C.
2. Aggiungere 1 mL di tampone HBSA senza calcio [HBSA-Ca(-)] [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, 0,1% (p/v) albumina sierica bovina] a ogni 100 μL di campione di plasma in una provetta da 1,5 mL.
3. Centrifugare i campioni di plasma a 20.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
4. Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
5. Ricostituire il pellet EV aggiungendo 1 mL di tampone HBSA-Ca(-) a ciascuna provetta, pipettare su e giù nella posizione del pellet EV e vorticare ogni provetta prima di centrifugare per una seconda volta a 20.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
6. Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
7. Ricostituire il pellet EV in 80 μL di HBSA-Ca(-) e pipettare su e giù nella posizione del pellet EV (Figura 2).

5. Opzione: isolamento di piccole vescicole extracellulari mediante ultracentrifuga

1. Dopo la fase 4.3, raccogliere il surnatante e l'ultracentrifuga a 100.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
2. Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
3. Ricostituire il pellet EV aggiungendo 1 mL di tampone HBSA-Ca(-) a ciascuna provetta e vorticare ciascuna provetta prima di ultracentrifugare per una seconda volta a 100.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
4. Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
5. Ricostituire il pellet EV in 80 μL di HBSA-Ca(-).

6. Misurazione dell'attività del fattore tissutale delle vescicole extracellulari

NOTA: I campioni EV devono essere pipettati e vortex per miscelare prima di essere aggiunti ai pozzetti. L'EDTA-disodio inibisce la capacità di FXa di scindere il substrato cromogenico. Pertanto, l'EDTA-disodio non può essere utilizzato come sostituto dell'EDTA-tetrasodio nella fase 6.7.

1. Aggiungere 40 μL di un campione EV a due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
2. Aggiungere 11 μL di IgG TF anti-umano di topo inibitorio [(36,4 μg/mL, concentrazione finale 7,8 μg/mL)] in un pozzetto di un campione EV e 11 μL di IgG di topo di controllo [(36,4 μg/mL, concentrazione finale 7,8 μg/mL)] nell'altro pozzetto.
3. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Durante il tempo di incubazione, preparare 50 μL/pozzetto di standard TF (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 pg/mL) in duplicato utilizzando TF ricombinante relipidato.
5. Preparare la miscela di fattori mescolando 4 mL di HBSA con calcio [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl₂, concentrazione finale 10 mM], 800 μL di 900 nM FX in HBSA-Ca(+) (concentrazione finale: 146,4 nM) e 120 μL di 200 nM FVIIa in HBSA-CA(+) (concentrazione finale: 4,8 nM).
6. Aggiungere 50 μL della soluzione di miscela di fattori in ciascun pozzetto, coprire la piastra con pellicola e incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °C.
7. Dopo 2 ore, interrompere la generazione di FXa aggiungendo 25 μL di tampone HBSA acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodio, concentrazione finale 5 mM] e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Ricostituire il substrato cromogenico scisso da FXa a 4 mM (aggiungere 8,7 mL di acqua distillata a un flaconcino da 25 mg).
9. Aggiungere 25 μL della soluzione di substrato cromogenico a ciascun pozzetto, coprire la piastra con pellicola e poi con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per 15 minuti a 37 °C.
10. Dopo 15 minuti di incubazione, rimuovere le bolle con un ago o per centrifugazione a 1.500 × g per 1 minuto.
11. Leggere la piastra a 405 nm utilizzando un lettore di piastre con una miscela prima della lettura.
12. Convertire la generazione FXa di ciascun pozzetto in attività TF utilizzando la curva standard generata utilizzando TF ricombinante relipidato.
13. Calcolare Generazione FXa dipendente da TF (attività EVTF) utilizzando l'equazione (1):
    Generazione FXa dipendente da TF (attività EVTF [pg/mL]) = Generazione FXa totale (pozzetto IgG di controllo) - Generazione FXa indipendente da TF (pozzetto IgG anti-TF) (Figura 3) (1)

Risultati

Un risultato positivo fornisce un valore di controllo positivo di ≥0,5 pg/mL e un valore di controllo negativo di <0,5 pg/mL. È meglio trovare un risponditore LPS elevato con >1,0 pg/mL di attività EVTF per un controllo positivo. Il risultato rappresentativo mostra l'attività EVTF delle vescicole extracellulari isolate dal plasma del sangue intero di 11 donatori sani, con e senza attivazione di LPS (Figura 4). Sei donatori su undici (donatori 2, 4, 5, 8, 10, 11) hanno risposto con LPS m...

Discussione

Qui viene presentato il protocollo del nostro test interno di attività EVTF. Il protocollo prevede tre passaggi critici. Quando si ricostituisce il pellet EV, è importante pipettare su e giù nella posizione del pellet EV anche se non è visibile. La ricostituzione incompleta del pellet EV comporterà un falso negativo o una sottostima dei valori di attività EVTF dei campioni. In secondo luogo, l'utilizzo di HBSA-Ca(+) è fondamentale nella fase 6.5 del protocollo perché la generazione di FXa non può essere generata...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55