細胞外小胞組織因子活性アッセイ

要約

ここでは、社内の細胞外小胞組織因子活性アッセイについて説明します。活性ベースのアッセイおよび抗原ベースのアッセイは、ヒト血漿サンプルからの細胞外小胞中の組織因子を測定するために使用されています。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも高い感度と特異性を持っています。

要約

組織因子(TF)は、第VII因子およびFVIIaの膜貫通型受容体です。TF/FVIIa複合体は、FIXとFXの両方を活性化することにより、凝固カスケードを開始します。TFは細胞外小胞(EV)の形で細胞から循環中に放出されます。TF陽性(⁺)EVのレベルは、がん、細菌およびウイルス感染、肝硬変などのさまざまな疾患で増加し、血栓症、播種性血管内凝固、疾患の重症度、および死亡率に関連しています。血漿中のTF⁺ EVを測定するには、抗原アッセイと活性ベースアッセイの2つの方法があります。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも感度と特異性が高いことがデータで示されています。本稿では、2段階のFXa生成アッセイに基づく当社独自のEVTF活性アッセイについて述べる。TF⁺ EV含有サンプルにFVIIa、FX、およびカルシウムを添加して、抗TF抗体の存在下および非存在下でFXaを生成し、TF依存性FXa生成とTF非依存性FXa生成を区別します。FXaで切断された発色基質を使用してFXaレベルを決定し、再置換組換えTFで生成された標準曲線を使用してTF濃度を決定します。この社内EVTF活性アッセイは、市販のTF活性アッセイよりも高い感度と特異性を備えています。

概要

血液凝固は、第VII/VIIa因子(F)が組織因子(TF)¹に結合することで開始されます。TF/FVIIa複合体は、FIXとFXの両方を活性化し、血液凝固を活性化^{します1。}完全長の膜結合型TFには、暗号化とアクティブの2つの形式があります。さらに、選択的スプライス形式のTF(asTF)があります。細胞膜の外側のリーフレットにあるスフィンゴミエリンとホスファチジルコリンは、TFを暗号化された状態に維持します^2,3,4。細胞が活性化または損傷されると、リン脂質スクランブラーゼはホスファチジルセリンおよび他の負に帯電したリン脂質を外尖1に転移^させる。細胞の活性化はまた、酸性スフィンゴミエリナーゼの外側のリーフレットへの転座をもたらし、そこでスフィンゴミエリンをセラミド⁵に分解します。これら 2 つのメカニズムは、暗号化された TF をアクティブな形式に変換します。また、プロテインジスルフィドイソメラーゼは、暗号化されたTF中のCys186とCys209の間のジスルフィド結合形成を媒介し、TF ^6,7,8

プロトコル

この研究は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の治験審査委員会(プロトコル番号:14-2108)によって承認されました。

1. ドナーからの採血

1. 21Gの針で肘前静脈にきれいな静脈穿刺を使用して全血を採取します。血液の最初の3 mLは、血管周囲細胞からのTFが含まれている可能性があるため、廃棄してください。.
2. 2.7 mLまたは1.8 mL(チューブのサイズに応じて)の血液を、3.2%クエン酸ナトリウム(0.109 mol/L)を含むバキュテナーに吸い込みます。チューブを過充填または過少充填しないでください。採血直後にチューブを静かに反転させ、クエン酸ナトリウムを分散させます。
3. 処理前にチューブを輸送する場合は、攪拌を避けてください。採血から2時間以内に血漿を調製します。

2. ネガティブコントロールプラズマの調製

注意: サンプルは、最終凍結前に氷上に置いないでください。

1. 健康なボランティアの全血を使用してネガティブコントロール血漿を準備します。採血後すぐに、以下のように無血小板血漿を調製します。
   1. 血液サンプルをバキュテナーチューブから15 mLチューブに移します。
   2. 2,....

ディスカッション

ここでは、当社社内EVTF活性アッセイのプロトコルを示します。このプロトコルには3つの重要なステップがあります。EVペレットを再構成する場合、EVペレットが見えない場合でも、EVペレットの位置でピペットを上下に動かすことが重要です。EVペレットの再構成が不完全な場合、サンプルのEVTF活性値の偽陰性または過小評価が発生します。第二に、カルシウムなしではFXa生成を生成できな?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55