Анализ активности факторов внеклеточной везикулярной ткани

Резюме

Здесь мы опишем собственный анализ активности фактора внеклеточной везикулярной ткани. Анализы, основанные на активности, и анализы на основе антигенов были использованы для измерения тканевого фактора во внеклеточных везикулах из образцов плазмы крови человека. Анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов.

Аннотация

Тканевый фактор (ТФ) является трансмембранным рецептором для факторов (F) VII и FVIIa. Комплекс TF/FVIIa инициирует коагуляционный каскад, активируя как FIX, так и FX. ТФ высвобождается из клеток в кровоток в виде внеклеточных везикул (ВВ). Уровень ТФ-положительных (⁺) ВВ повышен при различных заболеваниях, включая онкологические, бактериальные и вирусные инфекции, цирроз печени, и связан с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и летальностью. Существует два способа измерения ^ТФ+ ВВ в плазме: анализ на основе антигена и анализ на основе активности. Данные свидетельствуют о том, что анализы, основанные на активности, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализы на основе антигенов. В этом документе описывается наш собственный анализ активности EVTF, основанный на двухступенчатом анализе генерации FXa. FVIIa, FX и кальций добавляют к образцам, содержащим ТФ⁺ EV, для генерации FXa в присутствии и отсутствии антител к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Для определения уровня FXa используется хромогенный субстрат, расщепленный FXa, в то время как стандартная кривая, сгенерированная с помощью релипированного рекомбинантного TF, используется для определения концентрации TF. Этот собственный анализ активности ЭВТФ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем коммерческий анализ активности ТФ.

Введение

Свертывание крови начинается со связывания фактора (F) VII/VIIa с тканевым фактором (TF)¹. Комплекс TF/FVIIa активирует как FIX, так и FX для активации свертывания крови¹. Существует две формы полноразмерного мембранного ТФ: зашифрованный и активный. Кроме того, существует альтернативно сплайсированная форма ТФ (asTF). Сфингомиелин и фосфатидилхолин в наружной створке клеточной мембраны поддерживают ТФ в зашифрованном состоянии ^2,3,4. Когда клетки активируются или повреждаются, фосфолипидная скрамблаза переносит фосфатидилсерин и другие отрицательно заряженные фосфолипиды на внешнюю створку¹. Активация клеток также приводит к транслокации кислой сфингомиелиназы на внешнюю створку, где она разлагает сфингомиелин до церамида⁵. Эти два механизма преобразуют зашифрованный TF в активную форму. Также предполагается, что белковая дисульфидизомераза опосредует образование дисульфидных связей между Cys186 и Cys209 в зашифрованном ТФ, что приводит к расшифровке ТФ ^6,7,8. asTF также присутствует в кровотоке, но у него отсутствует трансмембранный домен, и поэтому он растворим ^9,10. Важно отметить, что asTF имеет очень низкий уровень прокоагулянтной активности по сравнению с полноразмерным активным TF^10,11.

Внеклеточные везикулы (ВВ) высвобождаются из покоящихся, активированных и умирающих клеток хозяина, а также из раковых клеток¹². ВВ экспрессируют белки из родительских клеток¹². Активные ТФ-содержащие ВВ высвобождаются из активированных моноцитов, эндотелиальных клеток и опухолевых клеток в кровоток 13,14,15. Уровни ТФ в плазме могут быть измерены с помощью анализов активности и антигенов. Анализы на основе антигенов включают ИФА и проточную цитометрию¹⁶. Существует два различных анализа активности: одноэтапный и двухэтапный анализ активности ТФ. Одноэтапный анализ основан на анализе свертывания крови на основе плазмы. Образец, содержащий ТФ, добавляют в плазму и измеряют время образования сгустка после повторной кальцификации. Двухступенчатый анализ измеряет генерацию образцов FXa путем добавления FVII или FVIIa, FX и кальция. Уровни FXa определяются с помощью субстрата, который расщепляется FXa.

Как в одностадийном, так и в двухступенчатом анализе активности ТФ концентрация ТФ определяется с помощью стандартной кривой, полученной с помощью рекомбинантного ТФ. Двухэтапные анализы обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем одностадийные. Многие исследования подтвердили, что анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов 17,18,19,20,21. Кроме того, наш собственный анализ активности имеет более высокую чувствительность и специфичность, чем анализ коммерческой деятельности²². Здоровые люди имеют очень низкие или неопределяемые уровни активности ЭВТФ в плазме. Напротив, лица с патологическими состояниями, такими как рак, цирроз печени, сепсис и вирусная инфекция, имеют обнаруживаемые уровни активности ЭВТФ, и это связано с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и смертностью 23,24,25,26,27,28. В этой статье мы опишем этот собственный двухступенчатый анализ активности EVTF.

протокол

Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (номер протокола: 14-2108).

1. Забор крови у доноров

1. Соберите цельную кровь с помощью чистой венепункции в локтевую вену иглой 21 G. Первые 3 мл крови выбросить, так как эта порция крови может содержать ТФ из периваскулярных клеток.
2. Наберите 2,7 или 1,8 мл (в зависимости от размера пробирок) крови в вакутейнер, содержащий 3,2% цитрата натрия (0,109 моль/л). Не переполняйте или недополняйте трубки. Осторожно переверните пробирки сразу после забора крови, чтобы диспергировать цитрат натрия.
3. Избегайте перемешивания, если пробирки транспортируются перед обработкой. Плазму готовят в течение 2 ч после забора крови.

2. Подготовка плазмы отрицательного контроля

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы не должны быть помещены на лед в любое время до окончательного замораживания.

1. Приготовьте отрицательную контрольную плазму, используя цельную кровь здоровых добровольцев. Сразу после забора крови подготовьте безтромбоцитарную плазму следующим образом.
   1. Переложите образцы крови из пробирок вакутейнера в пробирки объемом 15 мл.
   2. Центрифугируют образцы крови при 2 500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре (20-24 °C) без тормоза.
   3. Перенесите надосадочную жидкость (бедную тромбоцитами плазму) в новую пробирку и повторите отжим в тех же условиях.
   4. Перенесите надосадочную жидкость (плазму, обедненную тромбоцитами) в новую пробирку.
   5. Раздробьте образец на ≥100 мкл аликвоты. Оставьте примерно 100 мкл на дне пробирки.
   6. Немедленно замораживают плазму, обедненную тромбоцитами, при температуре −80 °C (рис. 1).

3. Подготовка плазмы положительного контроля

ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция на липополисахарид варьируется у разных людей.

1. Переложите образцы крови из вакутейнеров в пробирки объемом 15 мл.
2. Приготовьте положительную контрольную плазму с использованием цельной крови здоровых добровольцев, стимулированной липополисахаридом (ЛПС) из Escherichia coli O111:B4 (10 мкг/мл) в течение 5 ч при 37 °C с перемешиванием.
3. После 5 ч инкубации выполните шаги 2.1.2 - 2.1.6.

4. Выделение внеклеточных везикул из плазмы

ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы EV могут быть не видны. Время размораживания зависит от объема образца, но обычно мы размораживаем плазму объемом 100 мкл в течение 30 минут при температуре 37 °C.

1. Размораживайте образцы плазмы при 37 °C.
2. Добавьте 1 мл HBSA без буфера кальция [HBSA-Ca(-)] [137 мМ NaCl, 5,38 мМ KCl, 5,55 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 0,1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина] к каждые 100 мкл образца плазмы в пробирке объемом 1,5 мл.
3. Центрифужные образцы плазмы при 20 000 × g в течение 15 мин при 4 °C.
4. Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
5. Восстановите гранулу EV, добавив 1 мл буфера HBSA-Ca(-) в каждую пробирку, пипетку вверх и вниз в месте расположения гранулы EV и встряхните каждую пробирку перед повторным центрифугированием при 20 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
6. Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
7. Восстановите гранулу EV в 80 мкл HBSA-Ca(-) и пипетку вверх и вниз в месте расположения гранулы EV (рис. 2).

5. Вариант: Выделение мелких внеклеточных везикул с помощью ультрацентрифуги

1. После шага 4.3 соберите надосадочную жидкость и ультрацентрифугу при 100 000 × г в течение 70 мин при 4 °C.
2. Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
3. Восстановите гранулу EV, добавив 1 мл буфера HBSA-Ca(-) в каждую пробирку и встряхните каждую пробирку перед повторным ультрацентрифугированием при 100 000 × г в течение 70 минут при 4 °C.
4. Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
5. Восстановите гранулу EV в 80 мкл HBSA-Ca(-).

6. Измерение активности фактора внеклеточной везикулярной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы EV должны быть пипетированы и хорошо перемешаны перед добавлением в лунки. ЭДТА-динатрий ингибирует способность FXa расщеплять хромогенный субстрат. Таким образом, ЭДТА-динатрий не может быть использован в качестве замены ЭДТА-тетранатрия на стадии 6.7.

1. Добавьте 40 мкл образца EV в две лунки 96-луночного планшета.
2. Добавьте 11 мкл ингибирующего мышиного античеловеческого TF IgG [(36,4 мкг/мл, конечная концентрация 7,8 мкг/мл)] в одну лунку образца EV и 11 мкл контрольного мышиного IgG [(36,4 мкг/мл, конечная концентрация 7,8 мкг/мл)] в другую лунку.
3. Инкубируйте 96-луночную планшет в течение 15 минут при комнатной температуре.
4. В течение инкубационного периода готовят 50 мкл/лунку стандартов ТФ (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 пг/мл) в двух экземплярах, используя релипированный рекомбинантный ТФ.
5. Приготовьте факторную смесь, смешав 4 мл HBSA с кальцием [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 мМ CaCl₂, конечная концентрация 10 мМ], 800 мкл 900 нМ FX в HBSA-Ca(+) (конечная концентрация: 146,4 нМ) и 120 мкл 200 нМ FVIIa в HBSA-CA(+) (конечная концентрация: 4,8 нМ).
6. В каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора факторной смеси, накрывают планшет пленкой и инкубируют 2 ч в инкубаторе при 37 °С.
7. Через 2 ч прекращают образование FXa, добавляя 25 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) [HBSA-Ca(-) + 25 мМ ЭДТА-тетранатрия, конечная концентрация 5 мМ] и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Восстановите хромогенный субстрат, расщепленный FXa до 4 мМ (добавьте 8,7 мл дистиллированной воды во флакон 25 мг).
9. Добавьте 25 мкл раствора хромогенного субстрата в каждую лунку, накройте планшет пленкой, а затем алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света, и инкубируйте в течение 15 минут при 37 °C.
10. После 15 мин инкубации пузырьки удаляют иглой или центрифугированием при 1 500 × г в течение 1 мин.
11. Считайте пластину на длине волны 405 нм с помощью считывателя пластин с одним смешением перед считыванием.
12. Преобразуйте генерацию FXa каждой скважины в активность ТФ, используя стандартную кривую, построенную с использованием релипированного рекомбинантного ТФ.
13. Рассчитаем TF-зависимую генерацию FXa (активность EVTF) по уравнению (1):
    TF-зависимая генерация FXa (активность EVTF [пг/мл]) = Общая генерация FXa (контрольная скважина IgG) - TF-независимая генерация FXa (анти-TF IgG-скважина) (Рисунок 3) (1)

Результаты

При успешном получении положительного контрольного значения ≥0,5 пг/мл и отрицательного контрольного значения <0,5 пг/мл. Для положительного контроля лучше всего найти ответчик с высоким ЛПС с активностью EVTF >1,0 пг/мл. Репрезентативный результат показывает активность ЭВТФ ВВ, выделенных ...

Обсуждение

Здесь представлен протокол нашего собственного анализа активности ЭВТФ. Протокол состоит из трех важнейших этапов. При восстановлении гранулы EV важно проводить пипеткой вверх и вниз в том месте, где находится гранула EV, даже если она не видна. Неполное восстановление гранулы EV приведе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55