Assay zur Aktivität des extrazellulären Vesikelgewebefaktors

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen hauseigenen extrazellulären Vesikel-Gewebefaktor-Aktivitätstest. Aktivitätsbasierte Assays und Antigen-basierte Assays wurden verwendet, um den Gewebefaktor in extrazellulären Vesikeln aus humanen Plasmaproben zu messen. Aktivitätsbasierte Assays haben eine höhere Sensitivität und Spezifität als Antigen-basierte Assays.

Zusammenfassung

Der Gewebefaktor (TF) ist ein Transmembranrezeptor für Faktor (F) VII und FVIIa. Der TF/FVIIa-Komplex initiiert die Gerinnungskaskade, indem er sowohl FIX als auch FX aktiviert. TF wird in Form von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus den Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Der Spiegel von TF-positiven (⁺) EVs ist bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, bakteriellen und viralen Infektionen und Zirrhose, erhöht und wird mit Thrombosen, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Schwere der Erkrankung und Mortalität in Verbindung gebracht. Es gibt zwei Möglichkeiten, TF⁺ EVs im Plasma zu messen: Antigen- und aktivitätsbasierte Assays. Die Daten deuten darauf hin, dass aktivitätsbasierte Assays eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen als antigenbasierte Assays. In diesem Artikel wird unser hauseigener EVTF-Aktivitätsassay beschrieben, der auf einem zweistufigen FXa-Generierungsassay basiert. FVIIa, FX und Kalzium werden zu den TF⁺ EV-haltigen Proben hinzugefügt, um FXa in Gegenwart und Abwesenheit von Anti-TF-Antikörpern zu erzeugen, um die TF-abhängige FXa-Generation von der TF-unabhängigen FXa-Generation zu unterscheiden. Ein chromogenes Substrat, das von FXa gespalten wird, wird verwendet, um den FXa-Gehalt zu bestimmen, während eine Standardkurve, die mit einem relipidierten rekombinanten TF erzeugt wird, für die Bestimmung der TF-Konzentration verwendet wird. Dieser hauseigene EVTF-Aktivitätsassay hat eine höhere Sensitivität und Spezifität als ein kommerzieller TF-Aktivitätstest.

Einleitung

Die Blutgerinnung wird durch die Bindung des Faktors (F) VII/VIIa an den Gewebefaktor (TF)¹ eingeleitet. Der TF/FVIIa-Komplex aktiviert sowohl FIX als auch FX, um die Blutgerinnung zu aktivieren¹. Es gibt zwei Formen von membrangebundener TF in voller Länge: verschlüsselt und aktiv. Darüber hinaus gibt es eine alternativ gespleißte Form von TF (asTF). Sphingomyelin und Phosphatidylcholin in der äußeren Hülle der Zellmembran halten TF in einem verschlüsselten Zustand ^2,3,4. Wenn Zellen aktiviert oder beschädigt werden, überträgt ....

Protokoll

Die Studie wurde vom Institutional Review Board der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt (Protokollnummer: 14-2108).

1. Blutentnahme bei Spendern

1. Vollblut mit sauberer Venenpunktion mit einer 21-G-Nadel in die Vena antecubitalis entnehmen. Verwerfen Sie die ersten 3 ml Blut, da dieser Teil des Blutes TF aus perivaskulären Zellen enthalten kann.
2. 2,7 oder 1,8 ml (je nach Größe der Röhrchen) Blut in einen Vakutainer mit 3,2 % Natriumcitrat (0,109 mol/l) geben. Über- oder unterfüllen Sie die Rohre nicht. Drehen Sie die Röhrchen unmittelbar nach der Blutentnahme vorsichtig um, um das Natriumc....

Diskussion

Hier wird das Protokoll unseres hauseigenen EVTF-Aktivitätstests vorgestellt. Das Protokoll besteht aus drei kritischen Schritten. Bei der Rekonstitution des EV-Pellets ist es wichtig, an der Stelle des EV-Pellets auf und ab zu pipettieren, auch wenn es nicht sichtbar ist. Eine unvollständige Rekonstitution des EV-Pellets führt zu einem falsch negativen Ergebnis oder zu einer Unterschätzung der EVTF-Aktivitätswerte der Proben. Zweitens ist die Verwendung von HBSA-Ca(+) in Protokollschritt 6.5 von entscheidender Bede.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55