Assay zur Aktivität des extrazellulären Vesikelgewebefaktors

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen hauseigenen extrazellulären Vesikel-Gewebefaktor-Aktivitätstest. Aktivitätsbasierte Assays und Antigen-basierte Assays wurden verwendet, um den Gewebefaktor in extrazellulären Vesikeln aus humanen Plasmaproben zu messen. Aktivitätsbasierte Assays haben eine höhere Sensitivität und Spezifität als Antigen-basierte Assays.

Zusammenfassung

Der Gewebefaktor (TF) ist ein Transmembranrezeptor für Faktor (F) VII und FVIIa. Der TF/FVIIa-Komplex initiiert die Gerinnungskaskade, indem er sowohl FIX als auch FX aktiviert. TF wird in Form von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus den Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Der Spiegel von TF-positiven (⁺) EVs ist bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, bakteriellen und viralen Infektionen und Zirrhose, erhöht und wird mit Thrombosen, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Schwere der Erkrankung und Mortalität in Verbindung gebracht. Es gibt zwei Möglichkeiten, TF⁺ EVs im Plasma zu messen: Antigen- und aktivitätsbasierte Assays. Die Daten deuten darauf hin, dass aktivitätsbasierte Assays eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen als antigenbasierte Assays. In diesem Artikel wird unser hauseigener EVTF-Aktivitätsassay beschrieben, der auf einem zweistufigen FXa-Generierungsassay basiert. FVIIa, FX und Kalzium werden zu den TF⁺ EV-haltigen Proben hinzugefügt, um FXa in Gegenwart und Abwesenheit von Anti-TF-Antikörpern zu erzeugen, um die TF-abhängige FXa-Generation von der TF-unabhängigen FXa-Generation zu unterscheiden. Ein chromogenes Substrat, das von FXa gespalten wird, wird verwendet, um den FXa-Gehalt zu bestimmen, während eine Standardkurve, die mit einem relipidierten rekombinanten TF erzeugt wird, für die Bestimmung der TF-Konzentration verwendet wird. Dieser hauseigene EVTF-Aktivitätsassay hat eine höhere Sensitivität und Spezifität als ein kommerzieller TF-Aktivitätstest.

Einleitung

Die Blutgerinnung wird durch die Bindung des Faktors (F) VII/VIIa an den Gewebefaktor (TF)¹ eingeleitet. Der TF/FVIIa-Komplex aktiviert sowohl FIX als auch FX, um die Blutgerinnung zu aktivieren¹. Es gibt zwei Formen von membrangebundener TF in voller Länge: verschlüsselt und aktiv. Darüber hinaus gibt es eine alternativ gespleißte Form von TF (asTF). Sphingomyelin und Phosphatidylcholin in der äußeren Hülle der Zellmembran halten TF in einem verschlüsselten Zustand ^2,3,4. Wenn Zellen aktiviert oder beschädigt werden, überträgt Phospholipid-Scramblase Phosphatidylserin und andere negativ geladene Phospholipide auf die äußere Packung¹. Die Aktivierung von Zellen führt auch zur Translokation der sauren Sphingomyelinase in die äußere Hülle, wo sie Sphingomyelin zu Ceramid⁵ abbaut. Diese beiden Mechanismen wandeln verschlüsselte TF in die aktive Form um. Es wird auch vorgeschlagen, dass die Protein-Disulfid-Isomerase die Disulfidbindungsbildung zwischen Cys186 und Cys209 in verschlüsselter TF vermittelt, was zu einer Entschlüsselung von TF ^6,7,8 führt. asTF ist ebenfalls im Blutkreislauf vorhanden, aber es fehlt die Transmembrandomäne und ist daher löslich ^9,10. Wichtig ist, dass asTF im Vergleich zu aktivem TF^10,11 in voller Länge eine sehr geringe prokoagulanziöse Aktivität aufweist.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von ruhenden, aktivierten und sterbenden Wirtszellen sowie von Krebszellen freigesetzt¹². EVs exprimieren Proteine aus ihren Elternzellen¹². Aktive TF-tragende EVs werden aus aktivierten Monozyten, Endothelzellen und Tumorzellen in den Blutkreislauf freigesetzt 13,14,15. Der TF-Gehalt im Plasma kann durch aktivitäts- und antigenbasierte Assays gemessen werden. Zu den Antigen-basierten Assays gehören ELISA und Durchflusszytometrie¹⁶. Es gibt zwei verschiedene aktivitätsbasierte Assays: einstufige und zweistufige TF-Aktivitätsassays. Der einstufige Assay basiert auf einem plasmabasierten Gerinnungsassay. Die TF-haltige Probe wird dem Plasma zugesetzt und die Zeit bis zur Bildung eines Gerinnsels nach der Rekalzifizierung gemessen. Der zweistufige Assay misst die FXa-Generierung von Proben durch Zugabe von FVII oder FVIIa, FX und Kalzium. FXa-Niveaus werden mit einem Substrat bestimmt, das von FXa gespalten wird.

Sowohl in den ein- als auch in den zweistufigen TF-Aktivitätsassays wird die TF-Konzentration anhand einer Standardkurve bestimmt, die mit rekombinantem TF erstellt wird. Zweistufige Assays haben eine höhere Sensitivität und Spezifität als der einstufige Assay. Viele Studien haben bestätigt, dass aktivitätsbasierte Assays eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen als antigenbasierte Assays 17,18,19,20,21. Darüber hinaus weist unser hauseigener Aktivitätsassay eine höhere Sensitivität und Spezifität auf als ein kommerzieller Aktivitätsassay²². Gesunde Personen haben eine sehr niedrige oder nicht nachweisbare EVTF-Aktivität im Plasma. Im Gegensatz dazu weisen Personen mit pathologischen Erkrankungen wie Krebs, Zirrhose, Sepsis und Virusinfektion nachweisbare EVTF-Aktivitäten auf, die mit Thrombosen, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Schwere der Erkrankung und Mortalität verbunden sind 23,24,25,26,27,28. Hier beschreiben wir diesen hauseigenen zweistufigen EVTF-Aktivitätstest.

Protokoll

Die Studie wurde vom Institutional Review Board der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt (Protokollnummer: 14-2108).

1. Blutentnahme bei Spendern

1. Vollblut mit sauberer Venenpunktion mit einer 21-G-Nadel in die Vena antecubitalis entnehmen. Verwerfen Sie die ersten 3 ml Blut, da dieser Teil des Blutes TF aus perivaskulären Zellen enthalten kann.
2. 2,7 oder 1,8 ml (je nach Größe der Röhrchen) Blut in einen Vakutainer mit 3,2 % Natriumcitrat (0,109 mol/l) geben. Über- oder unterfüllen Sie die Rohre nicht. Drehen Sie die Röhrchen unmittelbar nach der Blutentnahme vorsichtig um, um das Natriumcitrat zu dispergieren.
3. Vermeiden Sie Bewegungen, wenn die Röhrchen vor der Verarbeitung transportiert werden. Bereiten Sie das Plasma innerhalb von 2 Stunden nach der Blutentnahme vor.

2. Herstellung von Negativkontrollplasma

HINWEIS: Die Proben sollten zu keinem Zeitpunkt vor dem endgültigen Einfrieren auf Eis gelegt werden.

1. Bereiten Sie Negativkontrollplasma mit Vollblut von gesunden Freiwilligen vor. Unmittelbar nach der Blutentnahme ist plättchenfreies Plasma wie folgt vorzubereiten.
   1. Blutproben aus den Vakutainer-Röhrchen in 15-ml-Röhrchen überführen.
   2. Blutproben bei 2.500 × g 15 min bei Raumtemperatur (20-24 °C) ohne Bremse zentrifugieren.
   3. Den Überstand (plättchenarmes Plasma) in ein neues Röhrchen überführen und den Schleudern unter den gleichen Bedingungen wiederholen.
   4. Den Überstand (plättchenarmes Plasma) in ein neues Röhrchen überführen.
   5. Aliquotieren Sie die Probe in ≥100 μl Aliquote. Lassen Sie ca. 100 μl am Boden des Röhrchens.
   6. Das plättchenarme Plasma wird sofort bei −80 °C eingefroren (Abbildung 1).

3. Herstellung von Positivkontrollplasma

HINWEIS: Die Reaktion auf Lipopolysaccharid ist von Person zu Person unterschiedlich.

1. Blutproben aus den Vakutainern in 15-ml-Röhrchen überführen.
2. Herstellung von Positivkontrollplasma mit Vollblut von gesunden Probanden, die mit Lipopolysaccharid (LPS) aus Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) für 5 h bei 37 °C unter Rühren stimuliert wurden.
3. Nach 5 Stunden Inkubation sind die Schritte 2.1.2 bis 2.1.6 zu befolgen.

4. Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Plasma

HINWEIS: EV-Pellets sind möglicherweise nicht sichtbar. Die Auftauzeit hängt vom Probenvolumen ab, aber normalerweise tauen wir 100 μl Plasma für 30 Minuten bei 37 °C auf.

1. Plasmaproben bei 37 °C auftauen.
2. 1 ml HBSA ohne Calcium [HBSA-Ca(-)]-Puffer [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM Glukose, 10 mM HEPES, 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin] zu je 100 μl Plasmaprobe in einem 1,5-ml-Röhrchen geben.
3. Plasmaproben bei 20.000 × g 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
4. Saugen Sie den Überstand bis auf 20 μl ab, ohne das EV-Pellet zu stören.
5. Rekonstituieren Sie das EV-Pellet, indem Sie 1 ml HBSA-Ca(-)-Puffer in jedes Röhrchen geben, an der Stelle des EV-Pellets auf und ab pipettieren und jedes Röhrchen vortexen, bevor Sie es ein zweites Mal bei 20.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
6. Saugen Sie den Überstand bis auf 20 μl ab, ohne das EV-Pellet zu stören.
7. Rekonstituieren Sie das EV-Pellet in 80 μl HBSA-Ca(-) und pipettieren Sie es an der Stelle des EV-Pellets auf und ab (Abbildung 2).

5. Option: Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel mittels Ultrazentrifuge

1. Nach Schritt 4.3 wird der Überstand und die Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 70 min bei 4 °C aufgefangen.
2. Saugen Sie den Überstand bis auf 20 μl ab, ohne das EV-Pellet zu stören.
3. Rekonstituieren Sie das EV-Pellet, indem Sie 1 ml HBSA-Ca(-)-Puffer in jedes Röhrchen geben und jedes Röhrchen vortexen, bevor Sie es ein zweites Mal bei 100.000 × g für 70 Minuten bei 4 °C ultrazentrifugieren.
4. Saugen Sie den Überstand bis auf 20 μl ab, ohne das EV-Pellet zu stören.
5. Rekonstituieren Sie das EV-Pellet in 80 μl HBSA-Ca(-).

6. Messung der Aktivität des extrazellulären Vesikelgewebefaktors

HINWEIS: EV-Proben sollten pipettiert und gut verwirbelt werden, um sie zu mischen, bevor sie in Vertiefungen gegeben werden. EDTA-Dinatrium hemmt die Fähigkeit von FXa, das chromogene Substrat zu spalten. Daher kann EDTA-Dinatrium in Schritt 6.7 nicht als Ersatz für EDTA-Tetranatrium verwendet werden.

1. Geben Sie 40 μl einer EV-Probe in zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
2. 11 μl eines inhibitorischen Maus-Anti-Human-TF-IgG [(36,4 μg/ml, Endkonzentration 7,8 μg/ml)] in eine Vertiefung einer EV-Probe und 11 μl Kontrollmaus-IgG [(36,4 μg/ml, Endkonzentration 7,8 μg/ml)] in die andere Vertiefung geben.
3. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Während der Inkubationszeit werden 50 μl/Well TF-Standards (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 und 20 pg/ml) in doppelter Ausführung mit relipidiertem rekombinantem TF hergestellt.
5. Bereiten Sie die Faktormischung vor, indem Sie 4 ml HBSA mit Calcium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl₂, Endkonzentration 10 mM], 800 μl 900 nM FX in HBSA-Ca(+) (Endkonzentration: 146,4 nM) und 120 μl 200 nM FVIIa in HBSA-CA(+) (Endkonzentration: 4,8 nM) mischen.
6. In jede Vertiefung werden 50 μl der Faktormischungslösung gegeben, die Platte mit Folie bedeckt und 2 h in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert.
7. Nach 2 h wird die FXa-Erzeugung durch Zugabe von 25 μl HBSA-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Puffer [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-Tetrasatrium, Endkonzentration 5 mM] gestoppt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
8. Rekonstituieren Sie das chromogene Substrat, das von FXa auf 4 mM gespalten wird (8,7 ml destilliertes Wasser in eine 25-mg-Durchstechflasche geben).
9. Geben Sie 25 μl der chromogenen Substratlösung in jede Vertiefung, decken Sie die Platte mit Folie und dann mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 °C.
10. Nach 15 Minuten Inkubation werden die Blasen mit einer Nadel oder durch Zentrifugieren bei 1.500 × g für 1 Minute entfernt.
11. Lesen Sie die Platte bei 405 nm mit einem Plattenleser mit einer Mischung vor dem Lesen ab.
12. Konvertieren Sie die FXa-Generierung jedes Wells in TF-Aktivität unter Verwendung der Standardkurve, die mit relipidiertem rekombinantem TF generiert wurde.
13. Berechnen Sie die TF-abhängige FXa-Erzeugung (EVTF-Aktivität) mit Gleichung (1):
    TF-abhängige FXa-Generierung (EVTF-Aktivität [pg/mL]) = Gesamt-FXa-Generierung (Kontroll-IgG-Well) - TF-unabhängige FXa-Generierung (Anti-TF-IgG-Well) (Abbildung 3) (1)

Ergebnisse

Ein erfolgreiches Ergebnis ergibt einen positiven Kontrollwert von ≥0,5 pg/ml und einen negativen Kontrollwert von <0,5 pg/ml. Für eine Positivkontrolle ist es am besten, einen hohen LPS-Responder mit einer EVTF-Aktivität von >1,0 pg/ml zu finden. Das repräsentative Ergebnis zeigt die EVTF-Aktivität von EVs, die aus dem Plasma des Vollbluts von 11 gesunden Spendern mit und ohne LPS-Aktivierung isoliert wurden (Abbildung 4). Sechs von elf Spendern (Spender 2, 4, 5, 8, 10, 11) hatten ein...

Diskussion

Hier wird das Protokoll unseres hauseigenen EVTF-Aktivitätstests vorgestellt. Das Protokoll besteht aus drei kritischen Schritten. Bei der Rekonstitution des EV-Pellets ist es wichtig, an der Stelle des EV-Pellets auf und ab zu pipettieren, auch wenn es nicht sichtbar ist. Eine unvollständige Rekonstitution des EV-Pellets führt zu einem falsch negativen Ergebnis oder zu einer Unterschätzung der EVTF-Aktivitätswerte der Proben. Zweitens ist die Verwendung von HBSA-Ca(+) in Protokollschritt 6.5 von entscheidender Bede...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55