细胞外囊泡组织因子活性测定

摘要

在这里，我们描述了一种内部细胞外囊泡组织因子活性测定。基于活性的测定和基于抗原的测定已被用于测量人血浆样品中细胞外囊泡中的组织因子。与基于抗原的检测相比，基于活性的检测具有更高的灵敏度和特异性。

摘要

组织因子 （TF） 是因子 （F） VII 和 FVIIa 的跨膜受体。TF/FVIIa 复合物通过激活 FIX 和 FX 启动凝血级联反应。TF 以细胞外囊泡 （EV） 的形式从细胞释放到循环中。TF 阳性 （⁺） EV 水平在各种疾病中升高，包括癌症、细菌和病毒感染以及肝硬化，并且与血栓形成、弥散性血管内凝血、疾病严重程度和死亡率有关。有两种方法可以测量血浆中的 TF⁺ EV：基于抗原和活性的测定。数据表明，基于活性的检测比基于抗原的检测具有更高的灵敏度和特异性。本文介绍了我们基于两阶段 FXa 生成测定的内部 EVTF 活性测定。将FVIIa，FX和钙添加到含TF ⁺ EV的样品中，以在存在和不存在抗TF抗体的情况下产生FXa，以区分TF依赖性FXa世代和TF非依赖性FXa世代。使用 FXa 切割的显色底物来测定 FXa 水平，而使用可靠的重组 TF 生成的标准曲线用于测定 TF 浓度。这种内部 EVTF 活性测定比商业 TF 活性测定具有更高的灵敏度和特异性。

引言

凝血是通过因子 （F） VII/VIIa 与组织因子 （TF）¹ 的结合开始的。TF/FVIIa 复合物可激活 FIX 和 FX 以激活凝血¹。全长膜结合TF有两种形式：加密和主动。此外，还有一种可变剪接形式的TF（asTF）。细胞膜外叶中的鞘磷脂和磷脂酰胆碱将 TF 维持在加密状态 ^2,3,4。当细胞被激活或损伤时，磷脂混血酶将磷脂酰丝氨酸和其他带负电荷的磷脂转移到外叶¹。细胞的活化还导致酸性鞘磷脂酶易位到外叶，在那里它将鞘磷脂降解为神经酰胺⁵。这两种机制将加密的 TF 转换为活动形式。也有人提出，蛋白质二硫键异构酶介导加密TF中Cys186和Cys209之间的二硫键形成，从而导致TF ^6,7,8的解密。asTF也存在于循环中，但缺乏跨膜结构域，因此可溶性^9,10

研究方案

该研究得到了北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会的批准（协议编号：14-2108）。

1. 从献血者那里采集血液

1. 使用 21 G 针头将干净的静脉穿刺收集到肘前静脉中。丢弃前 3 mL 血液，因为这部分血液可能含有来自血管周围细胞的 TF。
2. 将 2.7 或 1.8 mL（取决于试管的大小）血液抽入含有 3.2% 柠檬酸钠 （0.109 mol/L） 的真空吸液器中。不要过度填充或不足管子。采血后立即轻轻倒置试管以分散柠檬酸钠。
3. 如果试管在加工前运输，请避免搅拌。在采血后2小时内制备血浆。

2.阴性对照血浆的制备

注意：在最终冷冻之前的任何时候都不应将样品放在冰上。

1. 使用来自健康志愿者的全血制备阴性对照血浆。采血后立即制备无血小板血浆，如下所示。
   1. 将血液样本从真空管转移到 15 mL 管中。
   2. 在室温（20-24°C）下以2,500× g 离心血液样品15分钟，无需制动器。
   3. 将上清液（贫血小板血浆）转移到新管中，并在相同条件下重复旋转。
   4. 将上清液（血小板耗竭血浆）转移到新管中。
   5. 将样品分装成 ....

讨论

在这里，介绍了我们内部EVTF活性测定的方案。该协议有三个关键步骤。复溶 EV 沉淀时，即使在 EV 沉淀不可见的位置，也要在 EV 沉淀的位置上下移液。EV 沉淀的不完全复溶将导致样品的 EVTF 活性值出现假阴性或低估。其次，在方案步骤6.5中使用HBSA-Ca（+）至关重要，因为没有钙就无法产生FXa生成。第三，使用EDTA-四钠而不是EDTA-二钠来阻止FXa的产生至关重要，因为后者会抑制FXa裂解显色底物的能力.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55