Ensayo de actividad del factor tisular de vesículas extracelulares

Resumen

Aquí describimos un ensayo interno de actividad del factor tisular de vesículas extracelulares. Se han utilizado ensayos basados en la actividad y ensayos basados en antígenos para medir el factor tisular en vesículas extracelulares a partir de muestras de plasma humano. Los ensayos basados en la actividad tienen una mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos.

Resumen

El factor tisular (TF) es un receptor transmembrana del factor (F) VII y FVIIa. El complejo TF/FVIIa inicia la cascada de la coagulación activando tanto FIX como FX. El TF se libera de las células a la circulación en forma de vesículas extracelulares (VE). El nivel de VE TF positivo (⁺) está aumentado en diversas enfermedades, como el cáncer, las infecciones bacterianas y virales y la cirrosis, y se asocia con trombosis, coagulación intravascular diseminada, gravedad de la enfermedad y mortalidad. Hay dos formas de medir los VE de TF⁺ en plasma: ensayos basados en antígenos y en actividades. Los datos indican que los ensayos basados en la actividad tienen una mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos. Este artículo describe nuestro ensayo interno de actividad EVTF basado en un ensayo de generación de FXa en dos etapas. FVIIa, FX y calcio se agregan a las muestras que contienen TF⁺ EV para generar FXa en presencia y ausencia de anticuerpos anti-TF para distinguir la generación de FXa dependiente de TF de la generación de FXa independiente de TF. Para determinar el nivel de FXa se utiliza un sustrato cromogénico escindido por FXa, mientras que para la determinación de la concentración de TF se utiliza una curva estándar generada con un TF recombinante relipidado. Este ensayo de actividad EVTF interno tiene una mayor sensibilidad y especificidad que un ensayo de actividad TF comercial.

Introducción

La coagulación sanguínea se inicia con la unión del factor (F) VII/VIIa al factor tisular (TF)¹. El complejo TF/FVIIa activa tanto FIX como FX para activar la coagulación sanguínea¹. Hay dos formas de TF de longitud completa unida a la membrana: encriptada y activa. Además, existe una forma alternativa de TF empalmada (asTF). La esfingomielina y la fosfatidilcolina en la valva externa de la membrana celular mantienen el TF en un estado encriptado ^2,3,4. Cuando las células se activan o se dañan, la fosfolípido scramblasa transfie....

Protocolo

La investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (número de protocolo: 14-2108).

1. Extracción de sangre de donantes

1. Extraer sangre entera mediante venopunción limpia en la vena antecubital con una aguja de 21 G. Deseche los primeros 3 ml de sangre porque esta porción de sangre puede contener TF de células perivasculares.
2. Extraiga 2,7 o 1,8 ml (dependiendo del tamaño de los tubos) de sangre en un vacutainer que contenga citrato de sodio al 3,2% (0,109 mol/L). No llene los tubos de más o de menos. Invierta suavemente los tubos inme....

Discusión

Aquí, se presenta el protocolo de nuestro ensayo de actividad EVTF interno. Hay tres pasos críticos en el protocolo. Al reconstituir el gránulo EV, es importante pipetear hacia arriba y hacia abajo en la ubicación del gránulo EV, incluso si no es visible. La reconstitución incompleta del gránulo de EV dará lugar a un falso negativo o a una subestimación de los valores de actividad de EVTF de las muestras. En segundo lugar, el uso de HBSA-Ca(+) es fundamental en el paso 6.5 del protocolo porque la generación de .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55