JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول وصفا مفصلا للعزل الفعال للحويصلات البولية خارج الخلية باستخدام حبات مغناطيسية وظيفية. علاوة على ذلك ، فإنه يشمل التحليلات اللاحقة ، بما في ذلك النشاف الغربي ، والبروتينات ، وعلم الفوسفوبروتيوميكس.

Abstract

اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) من السوائل الحيوية مؤخرا اهتماما كبيرا في مجال الخزعة السائلة. يتم إطلاقها بواسطة كل نوع من الخلايا تقريبا ، وهي توفر لقطة في الوقت الفعلي للخلايا المضيفة وتحتوي على ثروة من المعلومات الجزيئية ، بما في ذلك البروتينات ، ولا سيما تلك التي تحتوي على تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) مثل الفسفرة ، باعتبارها اللاعب الرئيسي للوظائف الخلوية وظهور المرض وتطوره. ومع ذلك ، لا يزال عزل المركبات الكهربائية عن السوائل الحيوية يمثل تحديا بسبب انخفاض الغلة والشوائب من طرق عزل المركبات الكهربائية الحالية ، مما يجعل التحليل النهائي لشحنات المركبات الكهربائية ، مثل البروتينات الفوسفاتية EV ، أمرا صعبا. هنا ، نصف طريقة عزل EV سريعة وفعالة تعتمد على حبات مغناطيسية وظيفية لعزل EV من السوائل الحيوية مثل البول البشري والبروتينات النهائية وتحليل phosphoproteomics بعد عزل EV. مكن البروتوكول من تحقيق عائد استرداد مرتفع من EVs البولية والملامح الحساسة للبروتين EV و phosphoproteome. علاوة على ذلك ، يتم تناول تنوع هذا البروتوكول والاعتبارات التقنية ذات الصلة هنا.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية مغلفة بالغشاء تفرزها جميع أنواع الخلايا وهي موجودة في السوائل الحيوية مثل الدم والبول واللعاب وما إلى ذلك 1،2،3،4. تحمل المركبات الكهربائية شحنة من الجزيئات النشطة بيولوجيا المتنوعة التي تعكس الحالة الفسيولوجية والمرضية للخلايا المضيفة ، وبالتالي تعمل كعوامل حاسمة في تطور المرض4،5،6. علاوة على ذلك ، أثبتت الدراسات المكثفة أنه يمكن تحديد علامات المرض القائمة على EV قبل ظهور الأعراض أو الكشف الفسيولوجي عن الأورام5،6،7.

تعمل الفسفرة كآلية رئيسية في الإشارات الخلوية والتنظيم. لذلك ، توفر البروتينات الفوسفاتية مصدرا قيما لاكتشاف العلامات الحيوية حيث ترتبط أحداث الفسفرة الشاذة بمسارات الإشارات الخلوية غير المنظمة وتطور المرض النقيلي مثل السرطان8،9،10. على الرغم من أن ديناميكيات الفسفرة تسمح بتحديد توقيعات البروتين الفوسفاتي الخاصة بالمرض كمؤشرات حيوية محتملة ، إلا أن الوفرة المنخفضة والطبيعة الديناميكية للبروتينات الفوسفاتية تشكل تحديات كبيرة في تطوير البروتينات الفوسفاتية كمؤشرات حيوية11،12. والجدير بالذكر أن البروتينات الفوسفاتية منخفضة الوفرة المغلفة داخل المركبات الكهربائية محمية من الهضم الأنزيمي الخارجي في البيئة خارج الخلية8. وبالتالي ، توفر المركبات الكهربائية والبروتينات الفوسفاتية المشتقة من EV مصدرا مثاليا لاكتشاف العلامات الحيوية في الكشف المبكر عن السرطان والأمراض الأخرى.

على الرغم من أن تحليل فسفرة البروتين في المركبات الكهربائية يوفر موردا قيما لفهم إشارات السرطان وتشخيص المرض في المراحل المبكرة ، إلا أن الافتقار إلى طرق عزل EV الفعالة يمثل عائقا رئيسيا. يتم تحقيق عزل EV بشكل شائع من خلال الطرد المركزي التفاضلي الفائق (DUC) 13. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا وليست مناسبة للآثار السريرية بسبب انخفاض الإنتاجية وضعف التكاثر13,14. طرق عزل EV البديلة ، مثل هطول الأمطار الناجم عن البوليمر15 ، محدودة بسبب الخصوصية المنخفضة بسبب الترسيب المشترك للبروتينات غير EV. توفر الأساليب القائمة على التقارب ، بما في ذلك التقاط التقارب القائم على الأجسام المضادة16 وترشيح التقارب17 ، خصوصية محسنة ولكنها تقتصر على معدل استرداد منخفض نسبيا بسبب الحجم الصغير.

لمعالجة المشكلات المتعلقة باستكشاف ديناميكيات البروتين الفوسفاتي في المركبات الكهربائية ، طورت مجموعتنا تقنية الاسترداد والتنقية الكلية للحويصلات خارج الخلية (EVtrap) بناء على التقارب الكيميائي لالتقاط المركبات الكهربائية على حبات مغناطيسية وظيفية18. أظهرت النتائج السابقة أن طريقة عزل EV القائمة على الخرزة المغناطيسية فعالة للغاية في عزل المركبات الكهربائية من مجموعة واسعة من عينات السوائل الحيوية وقادرة على تحقيق إنتاجية EV أعلى بكثير مع تقليل التلوث مقارنة ب DUC وطرق العزل الأخرى الموجودة18,19. لقد استخدمنا بنجاح EVtrap وطريقة تخصيب الفوسفوببتيد القائمة على التيتانيوم التي طورتها مجموعتنا20 لتحديد ملامح فوسفوبروتيوم المركبات الكهربائية المشتقة من السوائل الحيوية المتنوعة وللكشف عن المؤشرات الحيوية المحتملة للبروتين الفوسفاتي لمختلف الأمراض19،21،22.

هنا ، نقدم بروتوكولا يعتمد على EVtrap لعزل المركبات الكهربائية المتداولة. يركز البروتوكول على المركبات الكهربائية البولية. نوضح أيضا توصيف المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام النشاف الغربي. ثم نقوم بتفصيل تحضير العينة واكتساب قياس الطيف الكتلي (MS) لكل من تحليلات البروتينات وعلم الفوسفوبروتيوميكس. يوفر هذا البروتوكول سير عمل فعال وقابل للتكرار لتحديد ملامح بروتين EV البولي و phosphoproteome ، مما سيسهل إجراء مزيد من الدراسات حول EVs وتطبيقاتها السريرية23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم جمع جميع عينات البول من الأفراد الأصحاء بعد الموافقة المستنيرة. كانت التجارب متوافقة مع جميع المعايير الأخلاقية التي تنطوي على عينات بشرية وتتوافق مع المبادئ التوجيهية من برنامج حماية البحوث البشرية بجامعة بوردو.

1. جمع العينات

  1. جهاز طرد مركزي 12 مل من عينة البول في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل لمدة 10 دقائق عند 2500 × جم ، 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلايا والأجسام المبرمج الكبيرة.
  2. انقل 10 مل من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل واستمر في عزل EV.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية وإذابتها عند 37 درجة مئوية عند الاستخدام.

2. عزل EV باستخدام نهج EVtrap

  1. أضف 0.5 مل من مخزن التحميل المؤقت (نسبة 1:10 فولت / فولت) و 100 ميكرولتر من ملاط حبة EVtrap (نسبة 1:50 فولت / فولت) إلى العينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. احتضان العينة عن طريق الدوران من طرف إلى طرف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بتجميع العينة عن طريق وضع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل على رف فاصل مغناطيسي. إزالة الطاف.
  4. أعد تعليق الخرزات في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ماصة بلطف لإعادة تعليق الخرز المرتبط بالمركبات الكهربائية.
  5. ضع الأنبوب على رف فاصل مغناطيسي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ونضح المادة الطافية. استخدم ماصة P200 لشفط المادة الطافية تماما وتجنب شفط الخرز.
  6. اغسل الخرزات ب 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل. أضف المخزن المؤقت مباشرة بعد شفط المادة الطافية لمنع جفاف الخرز.
  7. اغسل الخرزات 2x مع 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضن الخرزات ب 100 ميكرولتر من ثلاثي إيثيل أمين 100 مللي متر طازج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واجمع المحلول المستحضر الذي يحتوي على EVs باستخدام رف فاصل مغناطيسي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: لتحضير 1 مل من 100 مللي متر ثلاثي إيثيل أمين ، قم بتخفيف 14 ميكرولتر من محلول ثلاثي إيثيل أمين في الماء.
  9. كرر الخطوة 2.8 وادمج المحاليل المستخلصة. جفف الشطف باستخدام مكثف طرد مركزي مفرغ عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. يمكن تخزين عينات EV المجففة في -80 درجة مئوية لعدة أشهر دون آثار ضارة على الخطوات التالية أو النتائج.

3. توصيف المركبات الكهربائية عن طريق النشاف الغربي

  1. أعد تعليق 5٪ من عينة EV المجففة (ما يعادل 0.5 مل من عينة البول) في 20 ميكرولتر من 1x مخزن عينة كبريتات دوديسيل الليثيوم (LDS) مع 10 مللي مول ديثيوثريتول (DTT).
    ملاحظة: المركبات الكهربائية من 0.5 مل من البول كافية للكشف عن إشارة CD9 (علامة EV24) في النشاف الغربي.
  2. تغلي العينة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. قم بتحميل العينة على هلام بولي أكريلاميد وقم بإجراء الرحلان الكهربائي والنشاف المناعي باتباع البروتوكولات القياسية25.
  3. بعد نقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين منخفض التألق (PVDF) ، قم بسد الغشاء ب 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في محلول ملحي ثلاثي التخزين 20 (TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لتحضير 1 لتر من المخزن المؤقت TBST ، أضف 19 mM Tris base و 137 mM NaCl و 1 mL من Tween-20 ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
  4. احتضان الغشاء بالجسم المضاد للأرانب المضاد ل CD9 بنسبة 1: 5000 في 1٪ BSA في TBST عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. اغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما باستخدام TBST. احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية IgG المضادة للأرانب والمرتبطة ب HRP بنسبة 1: 5000 في 1٪ BSA في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما باستخدام TBST. أضف ركائز التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) التي تم الحصول عليها تجاريا (نسبة 1: 1) على الغشاء واكتشف الإشارات على نظام تصوير التلألؤ الكيميائي.

4. تحضير العينة لتحليل البروتيوميات والفوسفوبروتيوميكس

  1. تحضير محلول تحلل طازج يحتوي على 12 مللي متر ديوكسي كولات الصوديوم (SDC) ، 12 مللي متر لورويل الصوديوم ساركوسينات (SLS) ، 100 مللي متر ثلاثي إيثيل الأمونيوم بيكربونات عازلة (TEAB) ، 10 مللي متر تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) ، 40 مللي متر كلوروأسيتاميد (CAA) ، وكوكتيلات مثبطة للفوسفاتيز 1x.
    ملاحظة: يتم سرد حلول الأسهم في وصف جدول المواد. يتم تحضير المخزن المؤقت للتحلل عن طريق إضافة محاليل المخزون لتحقيق التركيزات المطلوبة اعتمادا على الحجم المطلوب.
  2. قم بإذابة عينة EV المجففة في 100 ميكرولتر من محلول التحلل وقم بتسخين العينة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 1100 دورة في الدقيقة.
  3. بعد تبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيفها خمسة أضعاف بإضافة 400 ميكرولتر من 50 مللي متر TEAB.
  4. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم المخزن المؤقت للتحلل المخفف خمسة أضعاف مع 50 مللي متر TEAB فارغا.
  5. أضف مزيج التربسين / Lys-C عند نسبة 1:50 وزن / وزن من الإنزيم إلى البروتين واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج عند 1100 دورة في الدقيقة.
  6. أضف 50 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 10٪ (TFA) لتحمض العينة.
  7. أضف 600 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل إلى العينات ودوامة الخليط لمدة 2 دقيقة.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 3 دقائق عند 20000 × جم وإزالة الطبقة العليا (الطبقة العضوية). تجنب إزعاج الواجهة أثناء الشفط.
  9. كرر الخطوات 4.7-4.8. تجفيف المرحلة المائية باستخدام مكثف الطرد المركزي فراغ.
  10. أعد تعليق العينة المجففة في 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لتحمض الببتيدات وتحلية العينة باستخدام طرف تحلية C18 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتكييف الطرف ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 80٪ أسيتونيتريل ، متبوعا ب 2x مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتحميل عينة الببتيد المحمضة في الطرف ثم اغسل الطرف 3x ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بالتخلص من الببتيدات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 80٪ أسيتونيتريل.
  11. تجفيف الشطف باستخدام مكثف الطرد المركزي فراغ. جفف 2٪ من عينة الببتيد (ما يعادل 0.2 مل من عينة البول) بشكل منفصل لتحليل البروتينات. استخدم بقية (98٪) من العينة لتحليل الفوسفوبروتيوميكس.
  12. قم بإثراء الببتيدات الفوسفوببتيد من العينة باستخدام مجموعة إثراء الفوسفوببتيد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه للتخصيب.
    1. أعد تعليق العينة المجففة في 200 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت. أضف 50 ميكرولتر من الخرز إلى العينة ورجها بقوة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل العينة بالخرز إلى الطرف المتصدع وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 100 × جم.
    2. اغسل الطرف ب 200 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، متبوعا بمحلول الغسيل 1 ، ثم المخزن المؤقت للغسيل 2. قم بإجراء جميع خطوات الغسيل الثلاث عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة لمدة 2 دقيقة عند 20 × جم ومرة واحدة لمدة 1 دقيقة عند 100 × جم.
    3. ضع الطرف مع الخرز في أنبوب جديد لجمع الببتيدات الفوسفوببتيدات. أضف 50 ميكرولتر من محلول الشطف إلى الطرف وأجهزة الطرد المركزي مرة واحدة لمدة دقيقتين عند 20 × جم. أضف 50 ميكرولتر أخرى من محلول الشطف إلى الطرف وأجهزة الطرد المركزي مرة واحدة لمدة دقيقتين عند 20 × جم. أجهزة الطرد المركزي مرة أخيرة لمدة 1 دقيقة في 100 × غرام.
  13. قم بتجفيف الببتيدات الفوسفاتية المشحونة باستخدام مكثف طرد مركزي مفرغ.

5. تحليل LC-MS / MS

ملاحظة: يمكن استخدام أنظمة/إعدادات LC-MS/MS المختلفة وطرق الحصول على البيانات، مثل الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA).

  1. أعد تعليق عينات البروتيوم / الفوسفوبروتيوم المجففة في 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب أ) وقم بتحميل العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بحقن العينات في MS وقت الرحلة المحاصر للحركة الأيونية من خلال نظام الكروماتوغرافيا السائلة (LC) واستخدم طريقة Whisper 40 القياسية المحددة مسبقا في اليوم. يتم فصل الببتيدات على عمود C18 15 سم (قطر داخلي 75 ميكرومتر ، حجم جسيمات 1.9 ميكرومتر) كما هو مذكور في جدول المواد.
  3. لتحليل البروتيوميات، الحصول على البيانات باستخدام تجزئة تسلسلية متوازية للتراكم مقترنة بطريقة اكتساب مستقلة عن البيانات (dia-PASEF) مع نطاق كتلة لكل منحدر يمتد من 300-1200 m/z ومن 0.6-1.50 1/K0 مع وقت دورة يبلغ 1.38 ثانية.
  4. لتحليل الفوسفوبروتيوميكس، الحصول على البيانات باستخدام طريقة اكتساب dia-PASEF مع نطاق كتلة لكل منحدر يمتد من 400-1550 م / ض و 0.6-1.50 1 / K0 مع وقت دورة 1.38 ثانية.
  5. قم بتحميل الملفات الأولية في برنامج البروتينات وقم بإجراء استخراج الإشارات وتحديد الهوية والقياس الكمي باستخدام سير عمل اكتساب بيانات مستقل خال من المكتبة.
    1. لإعدادات البحث ، استخدم قاعدة بيانات Homo sapiens ، وأنواع هضم محددة مع إنزيمات التربسين / P ، و 7 الحد الأدنى لطول الببتيد ، و 52 الحد الأقصى لطول الببتيد ، واثنين من الانقسام المفقود ، وكارباميدوميثيل في السيستين كتعديل ثابت ، وبروتين الأسيتيل N-term ، والأكسدة في الميثيونين ، والفسفرة في سيرين ، ثريونين ، وتيروزين (لتحليل الفوسفوبروتيوميكس) كتعديلات متغيرة ، و 5 كتعديلات متغيرة قصوى. اضبط FDR على PSM والببتيد ومجموعة البروتين على 0.01.
      ملاحظة: تم استخدام برنامج Spectronaut في هذا البروتوكول. كما يتم استخدام برامج البحث عن بيانات DIA الأخرى مثل DIA-NN و PEAKS بشكل شائع. إذا تم الحصول على البيانات في وضع DDA ، فإن برامج مثل MaxQuant و Proteome Discoverer قابلة للتطبيق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوضح هذا البروتوكول سير عمل شامل من عزل المركبات الكهربائية إلى البروتينات النهائية وتحليلات الفوسفوبروتيوميكس (الشكل 1). خضعت عينات البول الثلاثية لعزل EV. تميزت المركبات الكهربائية المعزولة بالنشاف الغربي وتمت معالجتها لاحقا لإعداد عينات البروتينات القائمة على قياس ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد العزل الفعال للمركبات الكهربائية شرطا أساسيا للكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة والبروتينات الفوسفاتية في المركبات الكهربائية. على الرغم من تطوير العديد من الطرق لتلبية هذه الحاجة ، لا تزال الغالبية تعاني من قيود مثل ضعف التعافي أو انخفاض قابلية التكاثر ، مما يعيق استخدامها في الدرا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون عن مصلحة مالية متنافسة. أنطون إليوك و دبليو آندي تاو هما مؤسسان مشاركان لشركة Tymora Analytical Operations ، التي طورت حبات EVtrap وقامت بتسويق مجموعة إثراء الفوسفوببتيد PolyMAC.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 3RF1AG064250 و R44CA239845.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeLife Science ProductsM-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1005
15 mL conical centrifuge tubeCorning 352097
15 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074P2
Benchtop incubated shakerBioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAbCell Signaling Technology13403S
ChloroacetamideSigma -AldrichC0267-100GUsed for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate Fisher Scientific E145-4Precipitates detergents
Evosep One EvosepLiquid chromatography system
EvotipsEvosepEV2013Sample loading for Evosep One system 
EVtrapTymora AnalyticalFunctionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF MembraneSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kitTymora AnalyticalPolymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate Sigma -AldrichD6750-10GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate Sigma -AldrichL9150-50GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HTBrukerTrapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips GlygenTT2C18.96Desalting method
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLFor EV elution. 
Triethylammonium bicabonate bufferSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Trifluoroacetic acidSigma -Aldrich302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma -AldrichC4706Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15(2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64(2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519(2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EVs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved