العزلة القائمة على التقارب الكيميائي للحويصلات خارج الخلية من السوائل الحيوية لتحليل البروتيوميات وعلم الفوسفوبروتيوميكس

Summary

يقدم هذا البروتوكول وصفا مفصلا للعزل الفعال للحويصلات البولية خارج الخلية باستخدام حبات مغناطيسية وظيفية. علاوة على ذلك ، فإنه يشمل التحليلات اللاحقة ، بما في ذلك النشاف الغربي ، والبروتينات ، وعلم الفوسفوبروتيوميكس.

Abstract

اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) من السوائل الحيوية مؤخرا اهتماما كبيرا في مجال الخزعة السائلة. يتم إطلاقها بواسطة كل نوع من الخلايا تقريبا ، وهي توفر لقطة في الوقت الفعلي للخلايا المضيفة وتحتوي على ثروة من المعلومات الجزيئية ، بما في ذلك البروتينات ، ولا سيما تلك التي تحتوي على تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) مثل الفسفرة ، باعتبارها اللاعب الرئيسي للوظائف الخلوية وظهور المرض وتطوره. ومع ذلك ، لا يزال عزل المركبات الكهربائية عن السوائل الحيوية يمثل تحديا بسبب انخفاض الغلة والشوائب من طرق عزل المركبات الكهربائية الحالية ، مما يجعل التحليل النهائي لشحنات المركبات الكهربائية ، مثل البروتينات الفوسفاتية EV ، أمرا صعبا. هنا ، نصف طريقة عزل EV سريعة وفعالة تعتمد على حبات مغناطيسية وظيفية لعزل EV من السوائل الحيوية مثل البول البشري والبروتينات النهائية وتحليل phosphoproteomics بعد عزل EV. مكن البروتوكول من تحقيق عائد استرداد مرتفع من EVs البولية والملامح الحساسة للبروتين EV و phosphoproteome. علاوة على ذلك ، يتم تناول تنوع هذا البروتوكول والاعتبارات التقنية ذات الصلة هنا.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية مغلفة بالغشاء تفرزها جميع أنواع الخلايا وهي موجودة في السوائل الحيوية مثل الدم والبول واللعاب وما إلى ^{ذلك 1}،²،^3،4. تحمل المركبات الكهربائية شحنة من الجزيئات النشطة بيولوجيا المتنوعة التي تعكس الحالة الفسيولوجية والمرضية للخلايا المضيفة ، وبالتالي تعمل كعوامل حاسمة في تطور المرض⁴،^5،6. علاوة على ذلك ، أثبتت الدراسات المكثفة أنه يمكن تحديد علامات المرض القائمة على EV قبل ظهور الأعراض أو الكشف الفسيولوجي عن ا....

Protocol

تم جمع جميع عينات البول من الأفراد الأصحاء بعد الموافقة المستنيرة. كانت التجارب متوافقة مع جميع المعايير الأخلاقية التي تنطوي على عينات بشرية وتتوافق مع المبادئ التوجيهية من برنامج حماية البحوث البشرية بجامعة بوردو.

1. جمع العينات

1. جهاز طرد مركزي 12 مل من عينة البول في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل لمدة 10 دقائق عند 2500 × جم ، 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلايا والأجسام المبرمج الكبيرة.
2. انقل 10 مل من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل واستمر في عزل EV.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية وإذابتها عند 37 درجة مئوية عند الاستخدام.

النتائج

يوضح هذا البروتوكول سير عمل شامل من عزل المركبات الكهربائية إلى البروتينات النهائية وتحليلات الفوسفوبروتيوميكس (الشكل 1). خضعت عينات البول الثلاثية لعزل EV. تميزت المركبات الكهربائية المعزولة بالنشاف الغربي وتمت معالجتها لاحقا لإعداد عينات البروتينات القائمة على قياس ال?.......

Discussion

يعد العزل الفعال للمركبات الكهربائية شرطا أساسيا للكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة والبروتينات الفوسفاتية في المركبات الكهربائية. على الرغم من تطوير العديد من الطرق لتلبية هذه الحاجة ، لا تزال الغالبية تعاني من قيود مثل ضعف التعافي أو انخفاض قابلية التكاثر ، مما يعيق استخدامها في الدرا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007