Proteomik ve Fosfoproteomik Analizler için Biyoakışkanlardan Hücre Dışı Veziküllerin Kimyasal Afiniteye Dayalı İzolasyonu

Özet

Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.

Özet

Biyosıvılardan elde edilen hücre dışı veziküller (EV'ler) son zamanlarda likit biyopsi alanında önemli bir ilgi görmüştür. Hemen hemen her hücre tipi tarafından salınırlar, konakçı hücrelerin gerçek zamanlı bir görüntüsünü sağlarlar ve proteinler, özellikle fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlara (PTM'ler) sahip olanlar da dahil olmak üzere çok sayıda moleküler bilgi içerirler. Bununla birlikte, mevcut EV izolasyon yöntemlerinden kaynaklanan düşük verim ve safsızlıklar nedeniyle EV'lerin biyoakışkanlardan izolasyonu zorlu olmaya devam etmekte ve bu da EV fosfoproteinleri gibi EV kargosunun aşağı akış analizini zorlaştırmaktadır. Burada, insan idrarı gibi biyosıvılardan EV izolasyonu için işlevselleştirilmiş manyetik boncuklara ve aşağı akış proteomiklerine ve EV izolasyonunu takiben fosfoproteomik analize dayalı hızlı ve etkili bir EV izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Protokol, idrar EV'lerinin ve EV proteomu ve fosfoproteomunun hassas profillerinin yüksek geri kazanım verimini sağladı. Ayrıca, bu protokolün çok yönlülüğü ve ilgili teknik hususlar da burada ele alınmaktadır.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücre tipleri tarafından salgılanan ve kan, idrar, tükürük vb. biyosıvılarda bulunan zar kapsüllü nanopartiküllerdir.1,2,3,4. EV'ler, konakçı hücrelerinin fizyolojik ve patolojik durumunu yansıtan çeşitli biyoaktif moleküllerden oluşan bir kargo taşır ve bu nedenle hastalığın ilerlemesinde çok önemli faktörler olarak işlev görür ^4,5,6. Ayrıca, kapsamlı çalışmalar, EV tabanlı hastalık belirteçlerinin semptomların b....

Protokol

Tüm idrar örnekleri sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı. Deneyler, insan örneklerini içeren tüm etik standartlara uygundu ve Purdue Üniversitesi İnsan Araştırmaları Koruma Programı'nın yönergelerine uygundu.

1. Örnek toplama

1. Hücre kalıntılarını ve büyük apoptotik cisimleri çıkarmak için 12 mL idrar örneğini 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde 10 dakika boyunca 2.500 x g, 4 ° C'de santrifüjleyin.
2. 10 mL süpernatanı 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve EV izolasyonuna devam edin.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C'de saklanabilir ve kullanı....

Tartışmalar

Etkili EV izolasyonu, EV'lerde düşük miktarda bulunan proteinleri ve fosfoproteinleri tespit etmek için temel bir ön koşuldur. Bu ihtiyacı karşılamak için çok sayıda yöntemin geliştirilmesine rağmen, çoğunluk hala büyük ölçekli çalışmalarda ve rutin klinik ortamlarda kullanımlarını engelleyen zayıf iyileşme veya düşük tekrarlanabilirlik gibi sınırlamalardan muzdariptir. DUC genellikle EV izolasyonu için en yaygın yöntem olarak kabul edilir ve hedef EV'lerin saflığını artırmaya ya.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007