Aislamiento Basado en la Afinidad Química de Vesículas Extracelulares a partir de Biofluidos para Análisis de Proteómica y Fosfoproteómica

Resumen

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) de los biofluidos han ganado recientemente una atención significativa en el campo de la biopsia líquida. Liberados por casi todos los tipos de células, proporcionan una instantánea en tiempo real de las células huésped y contienen una gran cantidad de información molecular, incluidas las proteínas, en particular aquellas con modificaciones postraduccionales (PTM) como la fosforilación, como el principal actor de las funciones celulares y la aparición y progresión de enfermedades. Sin embargo, el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de biofluidos sigue siendo un reto debido a los bajos rendimientos y las impurezas de los métodos actuales de aislamiento de los vehículos eléctricos, lo que dificulta el análisis posterior de la carga de los vehículos eléctricos, como las fosfoproteínas de los mismos. Aquí, describimos un método rápido y efectivo de aislamiento de EV basado en perlas magnéticas funcionalizadas para el aislamiento de EV de biofluidos como la orina humana y el análisis de proteómica y fosfoproteómica aguas abajo después del aislamiento de EV. El protocolo permitió un alto rendimiento de recuperación de las VE urinarias y perfiles sensibles del proteoma y el fosfoproteoma de las VE. Además, aquí también se abordan la versatilidad de este protocolo y las consideraciones técnicas pertinentes.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas encapsuladas en membranas secretadas por todo tipo de células y están presentes en biofluidos como sangre, orina, saliva, etc.1,2,3,4. Los VE transportan una carga de diversas moléculas bioactivas que reflejan el estado fisiológico y patológico de sus células huésped y, por lo tanto, funcionan como factores cruciales en la progresión de la enfermedad ^4,5,6. Además, amplios estudios han establecido que los marcadores de enfermedad basados en VE pueden identificarse antes de la aparición de los síntomas o de la detección fisiológica de los tumores ^5,6,7.

La fosforilación actúa como un mecanismo clave en la señalización y regulación celular. Por lo tanto, las fosfoproteínas proporcionan una fuente valiosa para el descubrimiento de biomarcadores, ya que los eventos de fosforilación aberrantes se asocian con vías de señalización celular desreguladas y el desarrollo de enfermedades metastásicas como el cáncer ^8,9,10. Aunque el perfil de la dinámica de fosforilación permite la identificación de firmas de fosfoproteínas específicas de la enfermedad como biomarcadores potenciales, la baja abundancia y la naturaleza dinámica de las fosfoproteínas plantean grandes desafíos en el desarrollo de fosfoproteínas como biomarcadores^11,12. En particular, las fosfoproteínas de baja abundancia encapsuladas dentro de los VE están protegidas de la digestión enzimática externa en el entorno extracelular⁸. En consecuencia, las VE y las fosfoproteínas derivadas de las VE ofrecen una fuente ideal para el descubrimiento de biomarcadores en la detección temprana del cáncer y otras enfermedades.

Aunque el análisis de la fosforilación de proteínas en las VE ofrece un recurso valioso para comprender la señalización del cáncer y el diagnóstico de la enfermedad en etapa temprana, la falta de métodos eficientes de aislamiento de VE presenta una barrera importante. El aislamiento de EV se logra comúnmente a través de la ultracentrifugación diferencial (DUC)¹³. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo y no tiene implicaciones clínicas debido al bajo rendimiento y la escasa reproducibilidad^13,14. Los enfoques alternativos de aislamiento de EV, como la precipitación inducida por polímeros¹⁵, están limitados por la baja especificidad debido a la coprecipitación de proteínas no EV. Los enfoques basados en la afinidad, incluida la captura de afinidad basada en anticuerpos¹⁶ y la filtración de afinidad¹⁷, ofrecen una mayor especificidad, pero están restringidos a una tasa de recuperación relativamente baja debido al pequeño volumen.

Para abordar los problemas en la exploración de la dinámica de las fosfoproteínas en las VE, nuestro grupo ha desarrollado la técnica de recuperación y purificación total de vesículas extracelulares (EVtrap) basada en la afinidad química para capturar las VE en perlas magnéticas funcionalizadas¹⁸. Resultados anteriores han demostrado que este método de aislamiento de VE basado en perlas magnéticas es altamente efectivo para aislar EV de una amplia gama de muestras de biofluidos y es capaz de lograr un rendimiento de EV mucho mayor al tiempo que minimiza la contaminación en comparación con DUC y otros métodos de aislamiento existentes^18,19. Hemos utilizado con éxito EVtrap y un método de enriquecimiento de fosfopéptidos a base de titanio desarrollado por nuestro grupo²⁰ para perfilar el fosfoproteoma de los VE derivados de diversos biofluidos y para detectar potenciales biomarcadores de fosfoproteínas para diversas enfermedades 19,21,22.

A continuación, presentamos un protocolo basado en EVtrap para el aislamiento de vehículos eléctricos circulantes. El protocolo se centra en los EV urinarios. También demostramos la caracterización de EVs aislados mediante Western blot. A continuación, detallamos la preparación de la muestra y la adquisición por espectrometría de masas (MS) para los análisis proteómicos y fosfoproteómicos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo eficiente y reproducible para perfilar el proteoma y el fosfoproteoma urinarios de la VE, lo que facilitará la realización de nuevos estudios sobre las VE y sus aplicaciones clínicas²³.

Protocolo

Todas las muestras de orina se recogieron de individuos sanos después del consentimiento informado. Los experimentos cumplieron con todos los estándares éticos que involucran muestras humanas y se ajustan a las pautas del Programa de Protección de la Investigación Humana de la Universidad de Purdue.

1. Recogida de muestras

1. Centrifugar 12 mL de muestra de orina en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL durante 10 min a 2.500 x g, 4 °C para eliminar restos celulares y cuerpos apoptóticos grandes.
2. Transfiera 10 ml del sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml y proceda con el aislamiento EV.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, y las muestras se pueden almacenar a -80 °C y descongelar a 37 °C tras su uso.

2. Aislamiento de vehículos eléctricos mediante el enfoque EVtrap

1. Agregue 0,5 ml de tampón de carga (relación 1:10 v/v) y 100 μl de lodo de perlas EVtrap (relación 1:50 v/v) a la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Incubar la muestra mediante rotación de extremo a extremo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Granule la muestra colocando el tubo cónico de 15 ml en una rejilla separadora magnética. Retire el sobrenadante.
4. Vuelva a suspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear suavemente para volver a suspender las perlas unidas a EV.
5. Coloque el tubo en una rejilla separadora magnética de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y aspire el sobrenadante. Utilice una pipeta P200 para aspirar completamente el sobrenadante y evitar aspirar las perlas.
6. Lave las perlas con 1 ml de tampón de lavado. Agregue el tampón inmediatamente después de aspirar el sobrenadante para evitar que las perlas se sequen.
7. Lave las perlas 2 veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
8. Incubar las perlas con 100 μL de trietilamina 100 mM recién preparada durante 10 min a temperatura ambiente y recoger la solución eluida que contiene EV utilizando una gradilla separadora magnética de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: Para preparar 1 ml de trietilamina 100 mM, diluya 14 μl de solución de trietilamina en agua.
9. Repita el paso 2.8 y combine las soluciones eluidas. Secar el eluido con un concentrador centrífugo de vacío a 4 °C.
   NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Las muestras secas de EV pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses sin efectos adversos en los siguientes pasos ni en los resultados.

3. Caracterización de las VE por Western blot

1. Resuspender el 5% de la muestra seca de EV (equivalente a 0,5 ml de la muestra de orina) en 20 μl de tampón de muestra de 1x dodecil sulfato de litio (LDS) con 10 mM de ditiotreitol (DTT).
   NOTA: Los EV de 0,5 ml de orina son suficientes para detectar la señal de CD9 (un marcador EV²⁴) en la transferencia de WESTERN.
2. Hervir la muestra durante 5 min a 95 °C. Cargar la muestra en un gel de poliacrilamida y realizar electroforesis e inmunotransferencia siguiendo los protocolos estándar²⁵.
3. Después de transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de baja fluorescencia, bloquee la membrana con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en solución salina tween-20 (TBST) tamponada con trís durante 1 h a temperatura ambiente. Para preparar 1 L de tampón TBST, agregue 19 mM de Tris base, 137 mM de NaCl y 1 mL de Tween-20; ajuste el pH a 7.4 usando HCl.
4. Incubar la membrana con el anticuerpo anti-CD9 de conejo en una proporción de 1:5.000 en BSA al 1% en TBST a 4 °C durante la noche o durante 2 h a temperatura ambiente.
5. Lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una con TBST. Incubar la membrana con anticuerpos secundarios ligados a HRP contra la IgG de conejo en una proporción de 1:5000 en BSA al 1% en TBST durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una con TBST. Agregue los sustratos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) obtenidos comercialmente (relación 1:1) en la membrana y detecte señales en un sistema de imágenes de quimioluminiscencia.

4. Preparación de muestras para análisis proteómico y fosfoproteómico

1. Prepare un tampón de lisis fresco que contenga 12 mM de desoxicolato de sodio (SDC), 12 mM de laurelil sarcosinato de sodio (SLS), 100 mM de tampón de bicarbonato de trietilamonio (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 40 mM de cloroacetamida (CAA) y 1 cóctel de inhibidores de fosfatasa.
   NOTA: Las soluciones madre se enumeran en la descripción de la Tabla de Materiales. El tampón de lisis se prepara añadiendo las soluciones madre para conseguir las concentraciones deseadas en función del volumen requerido.
2. Solubilizar la muestra seca de EV en 100 μL de tampón de lisis y calentar la muestra durante 10 min a 95 °C con agitación a 1.100 rpm.
3. Después de enfriar la muestra a temperatura ambiente, diluirla cinco veces añadiendo 400 μL de 50 mM de TEAB.
4. Mida la concentración de proteínas con un kit de ensayo de BCA según las instrucciones del fabricante. Utilice el tampón de lisis diluido cinco veces con 50 mM de TEAB como blanco.
5. Añadir la mezcla de tripsina/Lys-C a una proporción enzima-proteína de 1:50 p/p e incubar la muestra a 37 °C durante la noche agitando a 1.100 rpm.
6. Añadir 50 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% para acidificar la muestra.
7. Añadir 600 μL de acetato de etilo a las muestras y vortexar la mezcla durante 2 min.
8. Centrifugar la muestra durante 3 min a 20.000 x g y retirar la capa superior (capa orgánica). Evite perturbar la interfaz durante la aspiración.
9. Repita los pasos 4.7 y 4.8. Secar la fase acuosa con un concentrador centrífugo de vacío.
10. Vuelva a suspender la muestra seca en 200 μL de AGT al 0,1 % para acidificar los péptidos y desalar la muestra con una punta desalinizadora C18 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Acondicionar la punta con 200 μL de AGT al 0,1% en acetonitrilo al 80%, seguido de 2x con 200 μL de AGT al 0,1%. Cargue la muestra de péptido acidificado en la punta y luego lave la punta 3 veces con 200 μL de AGT al 0,1%. Eluir los péptidos con 200 μL de AGT al 0,1% en acetonitrilo al 80%.
11. Seque el eluido con un concentrador de centrífuga al vacío. Secar el 2% de la muestra peptídica (equivalente a 0,2 mL de la muestra de orina) por separado para el análisis proteómico. Utilizar el resto (98%) de la muestra para el análisis de fosfoproteómica.
12. Enriquezca los fosfopéptidos de la muestra utilizando un kit de enriquecimiento de fosfopéptidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice los pasos que se describen a continuación para el enriquecimiento.
    1. Vuelva a suspender la muestra seca en 200 μL de tampón de carga. Añadir 50 μL de las perlas a la muestra y agitar vigorosamente durante 20 min a temperatura ambiente. Cargue la muestra con las perlas en la punta fritada y centrifugue durante 1 min a 100 x g.
    2. Lave la punta con 200 μL de tampón de carga, seguido del tampón de lavado 1 y, a continuación, del tampón de lavado 2. Realice los tres pasos de lavado centrifugando una vez durante 2 min a 20 x g y otra vez durante 1 min a 100 x g.
    3. Coloque la punta con perlas en un tubo nuevo para recoger los fosfopéptidos eluidos. Añadir 50 μL de tampón de elución a la punta y centrifugar una vez durante 2 min a 20 x g. Añadir otros 50 μL de tampón de elución a la punta y centrifugar una vez durante 2 min a 20 x g. Centrifugar una última vez durante 1 min a 100 x g.
13. Secar los fosfopéptidos eluidos utilizando un concentrador centrífugo al vacío.

5. Análisis LC-MS/MS

NOTA: Se pueden utilizar diferentes sistemas/configuraciones LC-MS/MS y métodos de adquisición de datos, como la adquisición dependiente de datos (DDA).

1. Vuelva a suspender las muestras secas de proteoma/fosfoproteoma en ácido fórmico al 0,1 % (disolvente A) y cargue las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Inyecte las muestras en MS de tiempo de vuelo de movilidad iónica atrapada a través del sistema de cromatografía líquida (LC) y utilice el método estandarizado preestablecido Whisper 40 muestras por día. Los péptidos se separan en una columna C18 de 15 cm (75 μm de diámetro interior, 1,9 μm de tamaño de partícula) como se menciona en la Tabla de Materiales.
3. Para el análisis proteómico, adquiera datos utilizando un método de adquisición de adquisición en serie combinado con un método de adquisición independiente de datos (dia-PASEF) con un rango de masa por rampa que abarca de 300 a 1200 m/z y de 0,6 a 1,50 1/K0 con un tiempo de ciclo de 1,38 s.
4. Para el análisis de fosfoproteómica, adquiera datos utilizando un método de adquisición dia-PASEF con un rango de masa por rampa que abarca de 400-1550 m/z y 0,6-1,50 1/K0 con un tiempo de ciclo de 1,38 s.
5. Cargue los archivos sin procesar en el software de proteómica y realice la extracción, identificación y cuantificación de señales mediante un flujo de trabajo de adquisición de datos independiente sin bibliotecas.
   1. Para la configuración de búsqueda, utilice la base de datos de Homo sapiens , tipos específicos de digestión con enzimas tripsina/P, 7 longitudes peptídicas mínimas, 52 longitudes peptídicas máximas, dos escisiones perdidas, carbamidometilo en la cisteína como modificación fija, proteína acetil N-term, oxidación en metionina y fosforilación en serina, treonina y tirosina (para análisis de fosfoproteómica) como modificaciones variables y 5 como modificaciones variables máximas. Establezca el FDR en PSM, peptídico y grupo de proteínas en 0,01.
      NOTA: En este protocolo se utilizó el software Spectronaut. También se utilizan habitualmente otros programas de búsqueda de datos de DIA, como DIA-NN y PEAKS. Si los datos se adquirieron en modo DDA, se aplican software como MaxQuant y Proteome Discoverer.

Resultados

Este protocolo demuestra un flujo de trabajo completo desde el aislamiento de los VE hasta los análisis de proteómica y fosfoproteómica posteriores (Figura 1). Las muestras de orina por triplicado se sometieron a aislamiento EV. Los VE aislados se caracterizaron mediante Western blot y posteriormente se procesaron para la preparación de muestras proteómicas basadas en espectrometría de masas, incluida la extracción de proteínas, la digestión enzimática y la limpieza de péptidos. P...

Discusión

El aislamiento eficaz de las VE es un requisito previo esencial para detectar proteínas y fosfoproteínas de baja abundancia en las VE. A pesar del desarrollo de numerosos métodos para satisfacer esta necesidad, la mayoría todavía sufren de limitaciones como una recuperación deficiente o una baja reproducibilidad, que impiden su utilización en estudios a gran escala y entornos clínicos rutinarios. El DUC se considera generalmente como el método más común para el aislamiento de los vehículos eléctricos, y los ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007