Aislamiento Basado en la Afinidad Química de Vesículas Extracelulares a partir de Biofluidos para Análisis de Proteómica y Fosfoproteómica

Resumen

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) de los biofluidos han ganado recientemente una atención significativa en el campo de la biopsia líquida. Liberados por casi todos los tipos de células, proporcionan una instantánea en tiempo real de las células huésped y contienen una gran cantidad de información molecular, incluidas las proteínas, en particular aquellas con modificaciones postraduccionales (PTM) como la fosforilación, como el principal actor de las funciones celulares y la aparición y progresión de enfermedades. Sin embargo, el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de biofluidos sigue siendo un reto debido a los bajos rendimientos y las impurezas de los métodos actuales de aislamiento de los vehículos eléctricos, lo que dificulta el análisis posterior de la carga de los vehículos eléctricos, como las fosfoproteínas de los mismos. Aquí, describimos un método rápido y efectivo de aislamiento de EV basado en perlas magnéticas funcionalizadas para el aislamiento de EV de biofluidos como la orina humana y el análisis de proteómica y fosfoproteómica aguas abajo después del aislamiento de EV. El protocolo permitió un alto rendimiento de recuperación de las VE urinarias y perfiles sensibles del proteoma y el fosfoproteoma de las VE. Además, aquí también se abordan la versatilidad de este protocolo y las consideraciones técnicas pertinentes.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas encapsuladas en membranas secretadas por todo tipo de células y están presentes en biofluidos como sangre, orina, saliva, etc.1,2,3,4. Los VE transportan una carga de diversas moléculas bioactivas que reflejan el estado fisiológico y patológico de sus células huésped y, por lo tanto, funcionan como factores cruciales en la progresión de la enfermedad ^4,5,6. Además, amplios estudios han establecido....

Protocolo

Todas las muestras de orina se recogieron de individuos sanos después del consentimiento informado. Los experimentos cumplieron con todos los estándares éticos que involucran muestras humanas y se ajustan a las pautas del Programa de Protección de la Investigación Humana de la Universidad de Purdue.

1. Recogida de muestras

1. Centrifugar 12 mL de muestra de orina en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL durante 10 min a 2.500 x g, 4 °C para eliminar restos celulares y cuerpos apoptóticos grandes.
2. Transfiera 10 ml del sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml y proceda con el aislamiento EV.
   NOTA: El....

Discusión

El aislamiento eficaz de las VE es un requisito previo esencial para detectar proteínas y fosfoproteínas de baja abundancia en las VE. A pesar del desarrollo de numerosos métodos para satisfacer esta necesidad, la mayoría todavía sufren de limitaciones como una recuperación deficiente o una baja reproducibilidad, que impiden su utilización en estudios a gran escala y entornos clínicos rutinarios. El DUC se considera generalmente como el método más común para el aislamiento de los vehículos eléctricos, y los .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007