Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica

Resumo

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença ^4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marcadores da doença baseados em EV podem ser identificados antes do início dos sintomas ou da detecção fisiológica de tumores5,6,7.

A fosforilação atua como um mecanismo chave na sinalização e regulação celular. Portanto, as fosfoproteínas fornecem uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores, uma vez que eventos aberrantes de fosforilação estão associados a vias de sinalização celular desreguladas e ao desenvolvimento de doenças metastáticas, como o câncer8,9,10. Embora a dinâmica de fosforilação do perfil permita a identificação de assinaturas de fosfoproteínas doença-específicas como potenciais biomarcadores, a baixa abundância e a natureza dinâmica das fosfoproteínas representam grandes desafios no desenvolvimento de fosfoproteínas como biomarcadores^11,12. Notavelmente, as fosfoproteínas pouco abundantes encapsuladas em EVs são protegidas da digestão enzimática externa no ambiente extracelular⁸. Consequentemente, EVs e fosfoproteínas derivadas de EV oferecem uma fonte ideal para a descoberta de biomarcadores na detecção em estágio inicial de câncer e outras doenças.

Embora a análise da fosforilação de proteínas em EVs ofereça um recurso valioso para a compreensão da sinalização do câncer e do diagnóstico de doenças em estágio inicial, a falta de métodos eficientes de isolamento de EV apresenta uma grande barreira. O isolamento da EV é comumente obtido por ultracentrifugação diferencial (DUC)¹³. No entanto, esse método é demorado e não é adequado para implicações clínicas devido ao baixo rendimento e à baixa reprodutibilidade^13,14. Abordagens alternativas de isolamento de EV, como a precipitação induzida por polímero¹⁵, são limitadas pela baixa especificidade devido à co-precipitação de proteínas não-EV. Abordagens baseadas em afinidade, incluindo captura de afinidade baseada em anticorpos¹⁶ e filtração por afinidade¹⁷, oferecem especificidade aprimorada, mas são restritas a uma taxa de recuperação relativamente baixa devido ao pequeno volume.

Para abordar as questões na exploração da dinâmica de fosfoproteínas em EVs, nosso grupo desenvolveu a técnica de recuperação e purificação total de vesículas extracelulares (EVtrap) baseada na afinidade química para capturar EVs em esferas magnéticas funcionalizadas¹⁸. Resultados anteriores demonstraram que este método de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas é altamente eficaz no isolamento de EVs de uma ampla gama de amostras de biofluidos e é capaz de alcançar um rendimento de EV muito maior, minimizando a contaminação em comparação com o DUC e outros métodos de isolamento existentes^18,19. Utilizamos com sucesso o EVtrap e um método de enriquecimento de fosfopeptídeos à base de titânio desenvolvido por nosso grupo²⁰ para traçar o perfil do fosfoproteoma de EVs derivados de diversos biofluidos e detectar potenciais biomarcadores de fosfoproteínas para várias doenças 19,21,22.

Aqui, apresentamos um protocolo baseado no EVtrap para o isolamento de EVs circulantes. O protocolo se concentra nos EVs urinários. Nós também demonstramos a caracterização de EVs isolados usando western blotting. Em seguida, detalhamos a preparação da amostra e a aquisição por espectrometria de massas (MS) para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente e reprodutível para o perfil do proteoma urinário do EV e do fosfoproteoma, o que facilitará estudos adicionais sobre EVs e suas aplicações clínicas²³.

Protocolo

Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue.

1. Coleta de amostras

1. Centrifugar 12 mL de amostra de urina em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL por 10 min a 2.500 x g, 4 °C para remover restos celulares e grandes corpos apoptóticos.
2. Transfira 10 mL do sobrenadante para um novo tubo de 15 mL e prossiga com o isolamento EV.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a -80 °C e descongeladas a 37 °C após o uso.

2. Isolamento de EV usando a abordagem EVtrap

1. Adicionar 0,5 ml de tampão de carga (relação 1:10 v/v) e 100 μL de pasta de esferas EVtrap (relação 1:50 v/v) à amostra de acordo com as instruções do fabricante.
2. Incubar a amostra por rotação de ponta a ponta durante 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Pastilhar a amostra colocando o tubo cônico de 15 mL em um rack separador magnético. Remova o sobrenadante.
4. Ressuspender as esferas em 1 mL de tampão de lavagem e transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipetar suavemente para ressuspender as contas ligadas ao EV.
5. Coloque o tubo em um rack separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e aspirar o sobrenadante. Use uma pipeta P200 para aspirar completamente o sobrenadante e evitar aspirar as contas.
6. Lave as contas com 1 mL de tampão de lavagem. Adicione o tampão imediatamente após aspirar o sobrenadante para evitar que as contas sequem.
7. Lavar as esferas 2x com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente.
8. Incubar as esferas com 100 μL de trietilamina 100 mM recém-preparada durante 10 minutos à temperatura ambiente e recolher a solução eluída contendo EV utilizando um separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Para preparar 1 mL de trietilamina 100 mM, diluir 14 μL de solução de trietilamina em água.
9. Repetir o passo 2.8 e combinar as soluções eluídas. Secar o eluato utilizando um concentrador centrífugo a vácuo a 4 °C.
   NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. As amostras secas de EV podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses sem efeitos adversos nas etapas seguintes ou nos resultados.

3. Caracterização de EVs por western blotting

1. Ressuspender 5% da amostra de EV seca (equivalente a 0,5 mL da amostra de urina) em 20 μL de tampão de amostra 1x dodecil sulfato de lítio (LDS) com 10 mM de ditiotreitol (TDT).
   NOTA: EVs de 0,5 mL de urina são suficientes para detectar o sinal CD9 (um marcador EV²⁴) no western blotting.
2. Ferver a amostra durante 5 min a 95 °C. Carregar a amostra em gel de poliacrilamida e realizar eletroforese e immunoblotting seguindo protocolos padronizados²⁵.
3. Após a transferência das proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de baixa fluorescência, bloquear a membrana com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução salina tamponada trefóide-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente. Para preparar 1 L de tampão TBST, adicionar 19 mM Tris base, 137 mM NaCl e 1 mL de Tween-20; ajustar o pH para 7,4 usando HCl.
4. Incubar a membrana com anticorpo anti-CD9 de coelho na proporção de 1:5.000 em BSA a 1% em TBST a 4 °C durante a noite ou por 2 h à temperatura ambiente.
5. Lave a membrana 3x por 5 min cada com TBST. Incubar a membrana com IgG anti-coelho, anticorpo secundário ligado à HRP na proporção de 1:5000 em BSA a 1% em TBST por 1 h à temperatura ambiente.
6. Lave a membrana 3x por 5 min cada com TBST. Adicione os substratos de quimioluminescência aprimorada (ECL) obtidos comercialmente (proporção 1:1) à membrana e detecte sinais em um sistema de imagem por quimioluminescência.

4. Preparo de amostras para análise proteômica e fosfoproteômica

1. Preparar tampão de lise fresco contendo 12 mM de desoxicolato de sódio (SDC), 12 mM de lauroyl sarcosinato de sódio (SLS), 100 mM tampão de bicarbonato de trietilamónio (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 40 mM de cloroacetamida (CAA) e 1x cocktails de inibidores de fosfatase.
   NOTA: As soluções de estoque estão listadas na descrição da Tabela de Materiais. O tampão de lise é preparado adicionando as soluções-mãe para atingir as concentrações desejadas dependendo do volume necessário.
2. Solubilizar a amostra de EV seca em 100 μL de tampão de lise e aquecer a amostra durante 10 min a 95 °C com agitação a 1.100 rpm.
3. Depois de arrefecer a amostra à temperatura ambiente, diluir-a cinco vezes adicionando 400 μL de TEAB 50 mM.
4. Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante. Use o tampão de lise diluído cinco vezes com TEAB 50 mM como branco.
5. Adicionar a mistura de tripsina/Lis-C a 1:50 p/p de relação enzima/proteína e incubar a amostra a 37 °C durante a noite com agitação a 1.100 rpm.
6. Adicionar 50 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 10% para acidificar a amostra.
7. Adicionar 600 μL de acetato de etila às amostras e agitar a mistura durante 2 min.
8. Centrifugar a amostra por 3 min a 20.000 x g e remover a camada superior (camada orgânica). Evite perturbar a interface durante a aspiração.
9. Repita as etapas 4.7-4.8. Secar a fase aquosa usando um concentrador centrífugo a vácuo.
10. Ressuspender a amostra seca em 200 μL de TFA 0,1% para acidificar peptídeos e dessalgar a amostra usando uma ponta de dessalinização C18 de acordo com as instruções do fabricante. Condicionar a ponta com 200 μL de TFA 0,1% em acetonitrila a 80%, seguido de 2x com 200 μL de TFA 0,1%. Coloque a amostra de peptídeo acidificado na ponta e, em seguida, lave a ponta 3x com 200 μL de TFA 0,1%. Eluir os peptídeos com 200 μL de TFA 0,1% em acetonitrila a 80%.
11. Secar o eluato usando um concentrador centrífugo a vácuo. Secar 2% da amostra de peptídeo (equivalente a 0,2 mL da amostra de urina) separadamente para análise proteômica. Utilizar o restante (98%) da amostra para análise fosfoproteômica.
12. Enriqueça os fosfopeptídeos da amostra usando um kit de enriquecimento de fosfopeptídeos de acordo com as instruções do fabricante. Execute as etapas descritas abaixo para enriquecimento.
    1. Ressuspender a amostra seca em 200 μL de tampão de carga. Adicionar 50 μL das contas à amostra e agitar vigorosamente durante 20 minutos à temperatura ambiente. Coloque a amostra com as contas na ponta frita e centrifuja por 1 min a 100 x g.
    2. Lavar a ponta com 200 μL de tampão de carga, seguido de lavar o tampão de lavagem 1 e, em seguida, lavar o tampão 2. Execute as três etapas de lavagem centrifugando uma vez por 2 min a 20 x g e uma vez por 1 min a 100 x g.
    3. Coloque a ponta com contas em um novo tubo para coletar os fosfopeptídeos eluídos. Adicionar 50 μL de tampão de eluição à ponta e centrifugar uma vez por 2 min a 20 x g. Adicionar mais 50 μL de tampão de eluição à ponta e centrifugar uma vez por 2 min a 20 x g. Centrifugar uma última vez por 1 min a 100 x g.
13. Secar os fosfopeptídeos eluídos usando um concentrador centrífugo a vácuo.

5. Análise de LC-MS/MS

NOTA: Diferentes sistemas/configurações LC-MS/MS e métodos de aquisição de dados, como aquisição dependente de dados (DDA) podem ser usados.

1. Ressuspender as amostras secas de proteoma/fosfoproteoma em ácido fórmico a 0,1% (solvente A) e carregar as amostras de acordo com as instruções do fabricante.
2. Injetar as amostras em MS de tempo de voo de mobilidade iônica aprisionada através do sistema de cromatografia líquida (LC) e usar o método padronizado predefinido Whisper 40 amostras por dia. Os peptídeos são separados em uma coluna C18 de 15 cm (75 μm de diâmetro interno, tamanho de partícula de 1,9 μm) conforme mencionado na Tabela de Materiais.
3. Para análise proteômica, adquira dados usando um método de aquisição de acumulação paralela-fragmentação seriada combinado com aquisição independente de dados (dia-PASEF) com uma faixa de massa por rampa abrangendo de 300-1200 m/z e de 0,6-1,50 1/K0 com um tempo de ciclo de 1,38 s.
4. Para a análise fosfoproteômica, adquirir dados usando um método de aquisição dia-PASEF com uma faixa de massa por rampa abrangendo de 400-1550 m/z e 0,6-1,50 1/K0 com um tempo de ciclo de 1,38 s.
5. Carregue os arquivos brutos no software proteomics e execute a extração, identificação e quantificação de sinais usando um fluxo de trabalho de aquisição independente de dados sem biblioteca.
   1. Para configurações de pesquisa, use o banco de dados do Homo sapiens , tipos específicos de digestos com enzimas tripsina/P, 7 comprimentos mínimos de peptídeos, 52 comprimentos máximos de peptídeos, duas clivagens perdidas, carbamidometil em cisteína como modificação fixa, proteína acetil N-termo, oxidação em metionina e fosforilação em serina, treonina e tirosina (para análise fosfoproteômica) como modificações variáveis e 5 como modificações variáveis máximas. Defina o FDR no PSM, peptídeo e grupo de proteínas como 0,01.
      NOTA: O software Spectronaut foi utilizado neste protocolo. Outros softwares de busca de dados DIA, como DIA-NN e PEAKS, também são comumente usados. Se os dados foram adquiridos no modo DDA, softwares como MaxQuant e Proteome Discoverer são aplicáveis.

Resultados

Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfo...

Discussão

O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007