Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique

Résumé

Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées. De plus, il englobe des analyses ultérieures, y compris le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) issues de biofluides ont récemment fait l’objet d’une attention particulière dans le domaine de la biopsie liquide. Libérés par presque tous les types de cellules, ils fournissent un instantané en temps réel des cellules hôtes et contiennent une multitude d’informations moléculaires, y compris les protéines, en particulier celles présentant des modifications post-traductionnelles (PTM) telles que la phosphorylation, en tant que principal acteur des fonctions cellulaires et de l’apparition et de la progression de la maladie. Cependant, l’isolement des VE des biofluides reste difficile en raison des faibles rendements et des impuretés des méthodes actuelles d’isolation des VE, ce qui rend difficile l’analyse en aval de la cargaison des VE, comme les phosphoprotéines des VE. Nous décrivons ici une méthode d’isolement rapide et efficace des VE basée sur des billes magnétiques fonctionnalisées pour l’isolement des VE à partir de biofluides tels que l’urine humaine et l’analyse protéomique et phosphoprotéomique en aval après l’isolement des VE. Le protocole a permis un rendement élevé de récupération des VE urinaires et des profils sensibles du protéome et du phosphoprotéome des VE. En outre, la polyvalence de ce protocole et les considérations techniques pertinentes sont également abordées ici.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules encapsulées dans une membrane sécrétées par tous les types de cellules et présentes dans les biofluides tels que le sang, l’urine, la salive, etc.1,2,3,4. Les VE transportent une cargaison de diverses molécules bioactives qui reflètent l’état physiologique et pathologique de leurs cellules hôtes et fonctionnent donc comme des facteurs cruciaux dans la progression de la maladie ^4,5,6. De plus, des études approfondies ont établi que les marqueurs de la maladie basés sur les VE peuvent être identifiés avant l’apparition des symptômes ou la détection physiologique des tumeurs ^5,6,7.

La phosphorylation agit comme un mécanisme clé dans la signalisation et la régulation cellulaires. Par conséquent, les phosphoprotéines constituent une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs, car les événements de phosphorylation aberrants sont associés à des voies de signalisation cellulaire déréglées et au développement de maladies métastatiques telles que le cancer ^8,9,10. Bien que le profilage de la dynamique de phosphorylation permette d’identifier des signatures phosphoprotéiques spécifiques à la maladie en tant que biomarqueurs potentiels, la faible abondance et la nature dynamique des phosphoprotéines posent des défis majeurs dans le développement de phosphoprotéines en tant que biomarqueurs^11,12. Notamment, les phosphoprotéines peu abondantes encapsulées dans les VE sont protégées de la digestion enzymatique externe dans l’environnement extracellulaire⁸. Par conséquent, les VE et les phosphoprotéines dérivées des VE constituent une source idéale pour la découverte de biomarqueurs dans la détection précoce du cancer et d’autres maladies.

Bien que l’analyse de la phosphorylation des protéines dans les VE offre une ressource précieuse pour comprendre la signalisation du cancer et le diagnostic précoce de la maladie, le manque de méthodes efficaces d’isolement des VE constitue un obstacle majeur. L’isolation des VE est généralement obtenue par ultracentrifugation différentielle (DUC)¹³. Cependant, cette méthode prend du temps et n’est pas adaptée aux implications cliniques en raison d’un faible débit et d’une mauvaise reproductibilité^13,14. D’autres approches d’isolement des VE, telles que la précipitation induite par les polymères¹⁵, sont limitées par une faible spécificité due à la coprécipitation de protéines non VE. Les approches basées sur l’affinité, y compris la capture d’affinité basée sur les anticorps¹⁶ et la filtration d’affinité¹⁷, offrent une spécificité accrue, mais sont limitées à un taux de récupération relativement faible en raison du faible volume.

Pour répondre aux enjeux de l’exploration de la dynamique des phosphoprotéines dans les VE, notre groupe a développé une technique de récupération et de purification totale des vésicules extracellulaires (EVtrap) basée sur l’affinité chimique pour capturer les VE sur des billes magnétiques fonctionnalisées¹⁸. Des résultats antérieurs ont démontré que cette méthode d’isolement des VE à base de billes magnétiques est très efficace pour isoler les VE d’une large gamme d’échantillons de biofluides et qu’elle est capable d’obtenir un rendement beaucoup plus élevé tout en minimisant la contamination par rapport à la DUC et à d’autres méthodes d’isolement existantes^18,19. Nous avons utilisé avec succès EVtrap et une méthode d’enrichissement en phosphopeptide à base de titane développée par notre groupe²⁰ pour profiler le phosphoprotéome des VE dérivés de divers biofluides et pour détecter des biomarqueurs phosphoprotéiques potentiels pour diverses maladies 19,21,22.

Nous présentons ici un protocole basé sur EVtrap pour l’isolement des VE en circulation. Le protocole se concentre sur les VE urinaires. Nous démontrons également la caractérisation de VE isolés à l’aide du western blot. Nous détaillons ensuite la préparation des échantillons et l’acquisition par spectrométrie de masse (MS) pour les analyses protéomiques et phosphoprotéomiques. Ce protocole fournit un flux de travail efficace et reproductible pour le profilage du protéome et du phosphoprotéome urinaires des VE, ce qui facilitera d’autres études sur les VE et leurs applications cliniques²³.

Protocole

Tous les échantillons d’urine ont été prélevés sur des personnes en bonne santé après consentement éclairé. Les expériences étaient conformes à toutes les normes éthiques impliquant des échantillons humains et aux directives du programme de protection de la recherche humaine de l’Université Purdue.

1. Prélèvement d’échantillons

1. Centrifuger 12 mL d’échantillon d’urine dans un tube à centrifuger conique de 15 mL pendant 10 min à 2 500 x g, 4 °C pour éliminer les débris cellulaires et les gros corps apoptotiques.
2. Transvaser 10 mL du surnageant dans un nouveau tube de 15 mL et procéder à l’isolement des VE.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici, et les échantillons peuvent être conservés à -80 °C et décongelés à 37 °C lors de leur utilisation.

2. Isolation des véhicules électriques à l’aide de l’approche EVtrap

1. Ajouter 0,5 mL de tampon de chargement (rapport 1 :10 v/v) et 100 μL de boue de billes EVtrap (rapport 1 :50 v/v) à l’échantillon selon les instructions du fabricant.
2. Incuber l’échantillon par rotation d’un bout à l’autre pendant 30 min à température ambiante.
3. Pelleter l’échantillon en plaçant le tube conique de 15 mL sur une grille de séparateur magnétique. Retirez le surnageant.
4. Remettre les billes en suspension dans 1 mL de tampon de lavage et transférer la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Pipeter doucement pour remettre en suspension les billes liées à l’EV.
5. Placez le tube sur une grille de séparateur magnétique de 1,5 ml de tube microcentrifuge et aspirez le surnageant. Utilisez une pipette P200 pour aspirer complètement le surnageant et éviter d’aspirer les billes.
6. Lavez les perles avec 1 mL de tampon de lavage. Ajouter le tampon immédiatement après l’aspiration du surnageant pour éviter que les billes ne se dessèchent.
7. Lavez les billes 2 fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante.
8. Incuber les billes avec 100 μL de triéthylamine 100 mM fraîchement préparée pendant 10 min à température ambiante et recueillir la solution éluée contenant des VE à l’aide d’un support de séparateur magnétique à tube microcentrifuge de 1,5 mL.
   REMARQUE : Pour préparer 1 mL de 100 mM de triéthylamine, diluer 14 μL de solution de triéthylamine dans de l’eau.
9. Répétez l’étape 2.8 et combinez les solutions éluées. Séchez l’éluat à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide à 4 °C.
   REMARQUE : l’expérience peut être mise en pause ici. Les échantillons de VE séchés peuvent être conservés à -80 °C pendant plusieurs mois sans effets indésirables sur les étapes suivantes ou les résultats.

3. Caractérisation des VE par western blot

1. Remettre en suspension 5 % de l’échantillon de VE séché (équivalent à 0,5 mL de l’échantillon d’urine) dans 20 μL de tampon d’échantillon 1x dodécylsulfate de lithium (LDS) avec 10 mM de dithiothréitol (DTT).
   REMARQUE : Les VE de 0,5 mL d’urine sont suffisantes pour détecter le signal CD9 (un marqueur EV²⁴) dans le Western blot.
2. Faites bouillir l’échantillon pendant 5 min à 95 °C. Charger l’échantillon sur un gel de polyacrylamide et effectuer l’électrophorèse et l’immunotransfert en suivant les protocoles standard²⁵.
3. Après avoir transféré les protéines sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à faible fluorescence, bloquez la membrane avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans une solution saline tween-20 (TBST) tamponnée au tris pendant 1 h à température ambiante. Pour préparer 1 L de tampon TBST, ajouter 19 mM de base Tris, 137 mM de NaCl et 1 mL de Tween-20 ; ajuster le pH à 7,4 à l’aide de HCl.
4. Incuber la membrane avec l’anticorps anti-CD9 de lapin dans un rapport de 1 :5 000 dans 1 % de BSA dans du TBST à 4 °C pendant la nuit ou pendant 2 h à température ambiante.
5. Lavez la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacune avec TBST. Incuber la membrane avec des anticorps secondaires anti-IgG de lapin, liés à HRP dans un rapport de 1 :5000 dans 1% BSA dans TBST pendant 1 h à température ambiante.
6. Lavez la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacune avec TBST. Ajoutez les substrats de chimiluminescence améliorée (ECL) obtenus dans le commerce (rapport 1 :1) sur la membrane et détectez les signaux sur un système d’imagerie par chimiluminescence.

4. Préparation d’échantillons pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique

1. Préparez un tampon de lyse frais contenant 12 mM de désoxycholate de sodium (SDC), 12 mM de lauroylsarcosinate de sodium (SLS), 100 mM de tampon de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), 40 mM de chloroacétamide (CAA) et 1 cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase.
   REMARQUE : Les solutions mères sont répertoriées dans la description de la table des matériaux. Le tampon de lyse est préparé en ajoutant les solutions mères pour obtenir les concentrations souhaitées en fonction du volume requis.
2. Solubiliser l’échantillon de VE séché dans 100 μL de tampon de lyse et chauffer l’échantillon pendant 10 min à 95 °C en agitant à 1 100 tr/min.
3. Après avoir refroidi l’échantillon à température ambiante, diluez-le cinq fois en ajoutant 400 μL de TEAB 50 mM.
4. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage BCA selon les instructions du fabricant. Utilisez le tampon de lyse dilué cinq fois avec 50 mM de TEAB comme blanc.
5. Ajouter le mélange trypsine/Lys-C à un rapport enzyme/protéine de 1 :50 p/p et incuber l’échantillon à 37 °C pendant la nuit en agitant à 1 100 tr/min.
6. Ajouter 50 μL d’acide trifluoroacétique (AGT) à 10 % pour acidifier l’échantillon.
7. Ajouter 600 μL d’acétate d’éthyle aux échantillons et faire tourbillonner le mélange pendant 2 min.
8. Centrifuger l’échantillon pendant 3 min à 20 000 x g et retirer la couche supérieure (couche organique). Évitez de perturber l’interface pendant l’aspiration.
9. Répétez les étapes 4.7 à 4.8. Séchez la phase aqueuse à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide.
10. Remettre l’échantillon séché en suspension dans 200 μL d’AGT à 0,1 % pour acidifier les peptides et dessaler l’échantillon à l’aide d’un embout de dessalage C18 selon les instructions du fabricant. Conditionner l’embout avec 200 μL d’AGT à 0,1 % dans de l’acétonitrile à 80 %, puis 2x avec 200 μL d’AGT à 0,1 %. Chargez l’échantillon de peptide acidifié dans l’embout, puis lavez l’embout 3 fois avec 200 μL d’AGT à 0,1 %. Éluer les peptides avec 200 μL d’AGT à 0,1 % dans de l’acétonitrile à 80 %.
11. Séchez l’éluat à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide. Séchez séparément 2 % de l’échantillon peptidique (équivalent à 0,2 mL de l’échantillon d’urine) pour l’analyse protéomique. Utilisez le reste (98 %) de l’échantillon pour l’analyse phosphoprotéomique.
12. Enrichissez les phosphopeptides de l’échantillon à l’aide d’un kit d’enrichissement en phosphopeptides selon les instructions du fabricant. Effectuez les étapes décrites ci-dessous pour l’enrichissement.
    1. Remettre l’échantillon séché en suspension dans 200 μL de tampon de chargement. Ajouter 50 μL de billes à l’échantillon et agiter vigoureusement pendant 20 min à température ambiante. Chargez l’échantillon avec les billes sur la pointe fritted et centrifugez pendant 1 min à 100 x g.
    2. Lavez la buse avec 200 μL de tampon de chargement, puis le tampon de lavage 1, puis le tampon de lavage 2. Effectuez les trois étapes de lavage en centrifugeant une fois pendant 2 min à 20 x g et une fois pendant 1 min à 100 x g.
    3. Placez l’embout avec les billes dans un nouveau tube pour recueillir les phosphopeptides élués. Ajouter 50 μL de tampon d’élution à la pointe et centrifuger une fois pendant 2 min à 20 x g. Ajouter 50 μL de tampon d’élution à la pointe et centrifuger une fois pendant 2 min à 20 x g. Centrifuger une dernière fois pendant 1 min à 100 x g.
13. Séchez les phosphopeptides élués à l’aide d’un concentrateur de centrifugation sous vide.

5. Analyse LC-MS/MS

REMARQUE : Différents systèmes/paramètres LC-MS/MS et méthodes d’acquisition de données, telles que l’acquisition dépendante des données (DDA), peuvent être utilisés.

1. Remettre en suspension les échantillons séchés de protéome/phosphoprotéome dans de l’acide formique à 0,1 % (solvant A) et charger les échantillons conformément aux instructions du fabricant.
2. Injecter les échantillons dans la spectrométrie MS à temps de vol à mobilité ionique piégée à travers le système de chromatographie en phase liquide (LC) et utiliser la méthode normalisée préréglée Whisper 40 échantillons par jour. Les peptides sont séparés sur une colonne C18 de 15 cm (diamètre intérieur de 75 μm, taille de particule de 1,9 μm) comme mentionné dans le tableau des matériaux.
3. Pour l’analyse protéomique, acquérir des données à l’aide d’une fragmentation en série à accumulation parallèle combinée à une méthode d’acquisition indépendante des données (dia-PASEF) avec une plage de masse par rampe s’étendant de 300 à 1200 m/z et de 0,6 à 1,50 1/K0 avec un temps de cycle de 1,38 s.
4. Pour l’analyse phosphoprotéomique, acquérir des données à l’aide d’une méthode d’acquisition dia-PASEF avec une plage de masse par rampe allant de 400 à 1550 m/z et de 0,6 à 1,50 1/K0 avec un temps de cycle de 1,38 s.
5. Chargez les fichiers bruts dans un logiciel de protéomique et effectuez l’extraction, l’identification et la quantification des signaux à l’aide d’un flux de travail d’acquisition indépendant des données sans bibliothèque.
   1. Pour les paramètres de recherche, utilisez la base de données Homo sapiens , des types de digestion spécifiques avec des enzymes trypsine/P, 7 longueurs de peptides minimales, 52 longueurs de peptides maximum, deux clivages manqués, carbamidométhyl à la cystéine comme modification fixe, N-term de la protéine acétyle, oxydation à la méthionine et phosphorylation à la sérine, à la thréonine et à la tyrosine (pour l’analyse phosphoprotéomique) comme modifications variables, et 5 comme modifications variables maximales. Réglez le FDR au PSM, au peptide et au groupe protéique sur 0,01.
      REMARQUE : Le logiciel Spectronaut a été utilisé dans ce protocole. D’autres logiciels de recherche de données DIA tels que DIA-NN et PEAKS sont également couramment utilisés. Si les données ont été acquises en mode DDA, des logiciels tels que MaxQuant et Proteome Discoverer sont applicables.

Résultats

Ce protocole illustre un flux de travail complet allant de l’isolement des VE aux analyses protéomiques et phosphoprotéomiques en aval (Figure 1). Les échantillons d’urine en trois exemplaires ont été soumis à l’isolement des véhicules électriques. Les VE isolés ont été caractérisés par transfert Western, puis traités pour la préparation d’échantillons protéomiques par spectrométrie de masse, y compris l’extraction de protéines, la digestion enzymatique et le net...

Discussion

L’isolement efficace des VE est une condition préalable essentielle à la détection de protéines et de phosphoprotéines peu abondantes dans les VE. Malgré le développement de nombreuses méthodes pour répondre à ce besoin, la majorité d’entre eux souffrent encore de limitations telles qu’une mauvaise récupération ou une faible reproductibilité, ce qui entrave leur utilisation dans les études à grande échelle et les contextes cliniques de routine. Le DUC est généralement considéré comme la méthod...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007