בידוד מבוסס זיקה כימית של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים לצורך פרוטאומיקה וניתוח פוספופרוטאומיקה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מפורטים לבידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות בשתן באמצעות חרוזים מגנטיים פונקציונליים. יתר על כן, הוא מקיף ניתוחים מאוחרים יותר, כולל כתמים מערביים, פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מנוזלים ביולוגיים זכו לאחרונה לתשומת לב משמעותית בתחום הביופסיה הנוזלית. הם משוחררים כמעט על ידי כל סוג של תא, מספקים תמונת מצב בזמן אמת של תאים מארחים ומכילים שפע של מידע מולקולרי, כולל חלבונים, במיוחד אלה עם שינויים לאחר תרגום (PTM) כגון זרחון, כשחקן העיקרי של תפקודי התא והתפרצות המחלה והתקדמותה. עם זאת, הבידוד של כלי רכב חשמליים מנוזלים ביולוגיים נותר מאתגר בשל תפוקות נמוכות וזיהומים משיטות הבידוד הנוכחיות של כלי רכב חשמליים, מה שהופך את הניתוח במורד הזרם של מטעני EV, כגון פוספופרוטאינים של EV, לקשה. במאמר זה אנו מתארים שיטת בידוד מהירה ויעילה של כלי רכב חשמליים המבוססת על חרוזים מגנטיים פונקציונליים לבידוד EV מנוזלים ביולוגיים כגון שתן אנושי וניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם לאחר בידוד EV. הפרוטוקול איפשר תשואת התאוששות גבוהה של כלי רכב חשמליים בשתן ופרופילים רגישים של פרוטאום EV ופוספופרוטום. יתר על כן, הרבגוניות של פרוטוקול זה ושיקולים טכניים רלוונטיים מטופלים גם כאן.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים עטופים בקרום המופרשים על ידי כל סוגי התאים ונמצאים בנוזלים ביולוגיים כגון דם, שתן, רוק וכו'.1,2,3,4. כלי רכב חשמליים נושאים מטען של מולקולות ביו-אקטיביות מגוונות המשקפות את המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התאים המארחים שלהם, ולכן מתפקדות כגורמים מכריעים בהתקדמות המחלה ^4,5,6. יתר על כן, מחקרים מקיפים קבעו כי ניתן לזהות סמני מחלה מבוססי EV לפני הופעת הסימפטומים או גילוי פיזיולוגי של גידולים ....

Protocol

כל דגימות השתן נאספו מאנשים בריאים לאחר הסכמה מדעת. הניסויים עמדו בכל הסטנדרטים האתיים הכוללים דגימות אנושיות ותאמו את ההנחיות של תוכנית הגנת המחקר האנושי של אוניברסיטת פרדו.

1. איסוף דוגמאות

1. צנטריפוגה 12 מ"ל של דגימת שתן בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל למשך 10 דקות ב 2,500 x גרם, 4 ° C כדי להסיר פסולת תאים וגופים אפופטוטיים גדולים.
2. מעבירים 10 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור חדש של 15 מ"ל וממשיכים בבידוד EV.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן את הדגימות ב -80 ° C ולהפשיר ב 37 ° C בעת השימוש.

2. בידוד EV בגישת EVtrap

1. הוסף 0.5 מ"ל....

תוצאות

פרוטוקול זה מדגים זרימת עבודה מקיפה מבידוד של כלי רכב חשמליים ועד לניתוחי פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם (איור 1). דגימות השתן המשולשות היו נתונות לבידוד EV. כלי הרכב החשמליים שבודדו התאפיינו בקרישה מערבית ולאחר מכן עובדו להכנת דגימות פרוטאומיקה מבוססות ספקטרומטר?.......

Discussion

בידוד יעיל של EV הוא תנאי מוקדם חיוני לאיתור חלבונים ופוספופרוטאינים בשפע נמוך בכלי רכב חשמליים. למרות פיתוחן של שיטות רבות למילוי צורך זה, רובן עדיין סובלות ממגבלות כגון התאוששות לקויה או יכולת שחזור נמוכה, המעכבות את השימוש בהן במחקרים רחבי היקף ובמסגרות קליניות שגרתיות. DUC נחשבת בדרך כל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007