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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) aus Bioflüssigkeiten haben in jüngster Zeit im Bereich der Flüssigbiopsie große Aufmerksamkeit erlangt. Sie werden von fast allen Zelltypen freigesetzt, liefern eine Echtzeit-Momentaufnahme der Wirtszellen und enthalten eine Fülle molekularer Informationen, darunter Proteine, insbesondere solche mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung, als Hauptakteur der zellulären Funktionen und des Ausbruchs und Fortschreitens von Krankheiten. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Bioflüssigkeiten ist jedoch aufgrund der geringen Ausbeuten und Verunreinigungen der derzeitigen Isolationsmethoden für Elektrofahrzeuge nach wie vor eine Herausforderung, was die nachgelagerte Analyse von EV-Fracht, wie z. B. EV-Phosphoproteinen, erschwert. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive EV-Isolierungsmethode, die auf funktionalisierten magnetischen Beads für die EV-Isolierung aus Bioflüssigkeiten wie menschlichem Urin und der nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse nach der EV-Isolierung basiert. Das Protokoll ermöglichte eine hohe Rückgewinnungsausbeute von EVs im Urin und empfindliche Profile des EV-Proteoms und Phosphoproteoms. Darüber hinaus werden hier auch auf die Vielseitigkeit dieses Protokolls und relevante technische Überlegungen eingegangen.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranverkapselte Nanopartikel, die von allen Arten von Zellen abgesondert werden und in Bioflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel usw. vorhanden sind.1,2,3,4. EVs tragen eine Ladung verschiedener bioaktiver Moleküle, die den physiologischen und pathologischen Zustand ihrer Wirtszellen widerspiegeln und daher als entscheidende Faktoren für das Fortschreiten der Krankheit fungieren 4,5,6. Darüber hinaus haben umfangreiche Studien gezeigt, dass EV-basierte Krankheitsmarker vor dem Auftreten von Symptomen oder der physiologischen Erkennung von Tumoren identifiziert werden können 5,6,7.

Die Phosphorylierung ist ein Schlüsselmechanismus für die zelluläre Signalübertragung und Regulation. Daher stellen Phosphoproteine eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern dar, da aberrante Phosphorylierungsereignisse mit dysregulierten zellulären Signalwegen und der Entwicklung metastasierender Krankheiten wie Krebs verbunden sind 8,9,10. Obwohl die Profilierung der Phosphorylierungsdynamik die Identifizierung krankheitsspezifischer Phosphoproteinsignaturen als potenzielle Biomarker ermöglicht, stellen die geringe Häufigkeit und die dynamische Natur von Phosphoproteinen große Herausforderungen bei der Entwicklung von Phosphoproteinen als Biomarker dar11,12. Bemerkenswert ist, dass die in EVs eingekapselten Phosphoproteine mit geringer Häufigkeit vor externer enzymatischer Verdauung in der extrazellulären Umgebung geschützt sind8. Folglich bieten EVs und EV-abgeleitete Phosphoproteine eine ideale Quelle für die Entdeckung von Biomarkern in der Früherkennung von Krebs und anderen Krankheiten.

Obwohl die Analyse der Proteinphosphorylierung in EVs eine wertvolle Ressource für das Verständnis von Krebssignalen und die Diagnose von Krankheiten im Frühstadium darstellt, stellt der Mangel an effizienten Methoden zur Isolierung von EVs ein großes Hindernis dar. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen wird in der Regel durch differentielle Ultrazentrifugation (DUC)13 erreicht. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und aufgrund des geringen Durchsatzes und der schlechten Reproduzierbarkeit nicht für klinische Implikationen geeignet13,14. Alternative EV-Isolierungsansätze, wie z. B. die polymerinduzierte Fällung15, sind durch eine geringe Spezifität aufgrund der Co-Präzipitation von Nicht-EV-Proteinen begrenzt. Affinitätsbasierte Ansätze, einschließlich Antikörper-basierter Affinitätserfassung16 und Affinitätsfiltration17, bieten eine verbesserte Spezifität, sind aber aufgrund des geringen Volumens auf eine relativ niedrige Wiederfindungsrate beschränkt.

Um die Probleme bei der Erforschung der Phosphoproteindynamik in EVs anzugehen, hat unsere Gruppe extrazelluläre Vesikel-Total-Recovery- und Reinigungstechniken (EVtrap) entwickelt, die auf chemischer Affinität basieren, um EVs auf funktionalisierten magnetischen Kügelchen einzufangen18. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass diese auf magnetischen Kügelchen basierende EV-Isolationsmethode bei der Isolierung von EVs aus einer Vielzahl von Bioflüssigkeitsproben sehr effektiv ist und im Vergleich zu DUC und anderen bestehenden Isolationsmethoden in der Lage ist, eine viel höhere EV-Ausbeute bei gleichzeitiger Minimierung der Kontamination zu erzielen18,19. Wir haben EVtrap und eine von unserer Gruppe20 entwickelte Methode zur Anreicherung von Phosphopeptiden auf Titanbasis erfolgreich eingesetzt, um das Phosphoproteom von EVs aus verschiedenen Bioflüssigkeiten zu profilieren und potenzielle Phosphoprotein-Biomarker für verschiedene Krankheiten zu erkennen 19,21,22.

Hier stellen wir ein auf EVtrap basierendes Protokoll zur Isolierung von zirkulierenden Elektrofahrzeugen vor. Das Protokoll konzentriert sich auf die EVs im Urin. Wir demonstrieren auch die Charakterisierung isolierter Elektrofahrzeuge mittels Western Blotting. Anschließend beschreiben wir die Probenvorbereitung und die Massenspektrometrie (MS)-Erfassung sowohl für Proteomik- als auch für Phosphoproteomik-Analysen. Dieses Protokoll bietet einen effizienten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Profilierung des EV-Proteoms und Phosphoproteoms im Urin, was weitere Studien zu EVs und ihren klinischen Anwendungen erleichternwird 23.

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Protokoll

Alle Urinproben wurden von gesunden Probanden nach Einverständniserklärung entnommen. Die Experimente entsprachen allen ethischen Standards mit menschlichen Proben und den Richtlinien des Purdue University Human Research Protection Program.

1. Probenentnahme

  1. Zentrifugieren Sie 12 ml Urinprobe in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 2.500 x g, 4 °C, um Zelltrümmer und große apoptotische Körper zu entfernen.
  2. 10 ml des Überstandes in ein neues 15-ml-Röhrchen überführen und mit der EV-Isolierung fortfahren.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, und die Proben können bei -80 °C gelagert und bei Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden.

2. Isolierung von Elektrofahrzeugen mit dem EVtrap-Ansatz

  1. 0,5 ml Ladepuffer (1:10 v/v-Verhältnis) und 100 μl EVtrap-Kügelchenaufschlämmung (1:50 v/v-Verhältnis) gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Probe geben.
  2. Inkubieren Sie die Probe durch End-über-Ende-Rotation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Pelletieren Sie die Probe, indem Sie das konische 15-ml-Röhrchen auf ein Magnetabscheidergestell legen. Entfernen Sie den Überstand.
  4. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 1 ml Waschpuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig, um die EV-gebundenen Kügelchen wieder zu suspendieren.
  5. Legen Sie das Röhrchen auf ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen-Magnetabscheidergestell und saugen Sie den Überstand ab. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um den Überstand vollständig abzusaugen und ein Ansaugen der Kügelchen zu vermeiden.
  6. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Waschpuffer. Fügen Sie den Puffer sofort nach dem Ansaugen des Überstandes hinzu, um ein Austrocknen der Perlen zu verhindern.
  7. Waschen Sie die Kügelchen 2x mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur.
  8. Inkubieren Sie die Kügelchen mit 100 μl frisch zubereitetem 100 mM Triethylamin für 10 Minuten bei Raumtemperatur und sammeln Sie die eluierte Lösung, die EVs enthält, mit einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen-Magnetabscheidergestell.
    HINWEIS: Zur Herstellung von 1 ml 100 mM Triethylamin werden 14 μl Triethylaminlösung in Wasser verdünnt.
  9. Wiederholen Sie Schritt 2.8 und kombinieren Sie die eluierten Lösungen. Das Eluat wird mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator bei 4 °C getrocknet.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Getrocknete EV-Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden, ohne dass die folgenden Schritte oder die Ergebnisse beeinträchtigt werden.

3. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch Western Blot

  1. Resuspendieren Sie 5 % der getrockneten EV-Probe (entsprechend 0,5 ml der Urinprobe) in 20 μl 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Probenpuffer mit 10 mM Dithiothreitol (DTT).
    HINWEIS: EVs ab 0,5 ml Urin reichen aus, um das CD9-Signal (ein EV-Marker24) im Western Blot zu erkennen.
  2. Die Probe wird 5 min bei 95 °C gekocht. Laden Sie die Probe auf ein Polyacrylamid-Gel und führen Sie Elektrophorese und Immunoblotting gemäß den Standardprotokollen25 durch.
  3. Nachdem die Proteine auf eine niedrig fluoreszierende Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) übertragen wurden, blockieren Sie die Membran mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween-20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Um 1 l TBST-Puffer herzustellen, fügen Sie 19 mM Trisbase, 137 mM NaCl und 1 ml Tween-20 hinzu; Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
  4. Membran mit Kaninchen-Anti-CD9-Antikörper im Verhältnis 1:5.000 in 1 % BSA in TBST bei 4 °C über Nacht oder 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit TBST. Die Membran wird 1 h lang bei Raumtemperatur mit Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpftem Sekundärantikörper im Verhältnis 1:5000 in 1% BSA in TBST inkubiert.
  6. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit TBST. Geben Sie die kommerziell erhältlichen ECL-Substrate (Enhanced Chemiluminescence) (Verhältnis 1:1) auf die Membran und detektieren Sie Signale auf einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem.

4. Probenvorbereitung für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

  1. Bereiten Sie frischen Lysepuffer mit 12 mM Natriumdesoxycholat (SDC), 12 mM Natriumlauroylsarcosinat (SLS), 100 mM Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB), 10 mM Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), 40 mM Chloracetamid (CAA) und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktails vor.
    HINWEIS: Die Lagerlösungen sind in der Beschreibung der Materialtabelle aufgeführt. Der Lysepuffer wird durch Zugabe der Stammlösungen hergestellt, um die gewünschten Konzentrationen in Abhängigkeit vom erforderlichen Volumen zu erreichen.
  2. Die getrocknete EV-Probe wird in 100 μl Lysepuffer gelöst und die Probe 10 Minuten lang bei 95 °C unter Schütteln bei 1.100 U/min erhitzt.
  3. Nachdem Sie die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt haben, verdünnen Sie sie um das Fünffache, indem Sie 400 μl 50 mM TEAB hinzufügen.
  4. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie den Lysepuffer fünffach verdünnt mit 50 mM TEAB als Blindwert.
  5. Die Trypsin/Lys-C-Mischung wird mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 w/w zugegeben und die Probe wird über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 1.100 U/min inkubiert.
  6. Fügen Sie 50 μl 10%ige Trifluoressigsäure (TFA) hinzu, um die Probe anzusäuern.
  7. Geben Sie 600 μl Ethylacetat zu den Proben und wirbeln Sie die Mischung 2 Minuten lang auf.
  8. Die Probe wird 3 min bei 20.000 x g zentrifugiert und die obere Schicht (organische Schicht) entfernt. Vermeiden Sie es, die Schnittstelle während der Aspiration zu stören.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 bis 4.8. Trocknen Sie die wässrige Phase mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.
  10. Resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 μl 0,1 % TFA, um die Peptide anzusäuern, und entsalzen Sie die Probe mit einer C18-Entsalzungsspitze gemäß den Anweisungen des Herstellers. Konditionieren Sie die Spitze mit 200 μl 0,1 % TFA in 80 % Acetonitril, gefolgt von 2x 200 μl 0,1 % TFA. Laden Sie die angesäuerte Peptidprobe in die Spitze und waschen Sie die Spitze dann 3x mit 200 μl 0,1% TFA. Die Peptide werden mit 200 μl 0,1 % TFA in 80 % Acetonitril eluiert.
  11. Trocknen Sie das Eluat mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator. Trocknen Sie 2 % der Peptidprobe (entsprechend 0,2 ml der Urinprobe) separat für die Proteomik-Analyse. Verwenden Sie den Rest (98 %) der Probe für die Phosphoproteomik-Analyse.
  12. Reichern Sie Phosphopeptide aus der Probe mit einem Phosphopeptid-Anreicherungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers an. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte für die Anreicherung aus.
    1. Resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 μl Ladepuffer. 50 μl der Kügelchen zur Probe geben und 20 min bei Raumtemperatur kräftig schütteln. Die Probe mit den Kügelchen in die Frittenspitze geben und 1 min bei 100 x g zentrifugieren.
    2. Waschen Sie die Spitze mit 200 μl Ladepuffer, gefolgt von Waschpuffer 1 und dann Waschpuffer 2. Alle drei Waschschritte werden durchgeführt, indem Sie einmal für 2 Minuten bei 20 x g und einmal für 1 Minute bei 100 x g zentrifugieren.
    3. Stecken Sie die Spitze mit den Perlen in ein neues Röhrchen, um die eluierten Phosphopeptide aufzufangen. Geben Sie 50 μl Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie einmal 2 Minuten lang bei 20 x g. Geben Sie weitere 50 μl Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie einmal 2 Minuten lang bei 20 x g. Ein letztes Mal 1 min bei 100 x g zentrifugieren.
  13. Trocknen Sie die eluierten Phosphopeptide mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.

5. LC-MS/MS-Analyse

HINWEIS: Es können verschiedene LC-MS/MS-Systeme/-Einstellungen und Datenerfassungsmethoden, wie z. B. die datenabhängige Erfassung (DDA), verwendet werden.

  1. Resuspendieren Sie die getrockneten Proteom-/Phosphoproteom-Proben in 0,1%iger Ameisensäure (Lösungsmittel A) und laden Sie die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Injizieren Sie die Proben durch das Flüssigchromatographie-System (LC) in eine Flugzeit-MS mit gefangener Ionenmobilität und verwenden Sie die voreingestellte standardisierte Whisper-Methode mit 40 Proben pro Tag. Die Peptide werden auf einer 15 cm C18-Säule (75 μm Innendurchmesser, 1,9 μm Partikelgröße) getrennt, wie in der Materialtabelle angegeben.
  3. Für die Proteomik-Analyse werden Daten mit einer parallelen akkumulationsseriellen Fragmentierung in Kombination mit einer datenunabhängigen Erfassungsmethode (dia-PASEF) mit einem Massenbereich pro Rampe von 300-1200 m/z und von 0,6-1,50 1/K0 mit einer Zykluszeit von 1,38 s erfasst.
  4. Für die Phosphoproteomik-Analyse werden Daten mit einer dia-PASEF-Erfassungsmethode mit einem Massenbereich pro Rampe von 400-1550 m/z und 0,6-1,50 1/K0 mit einer Zykluszeit von 1,38 s erfasst.
  5. Laden Sie die Rohdateien in die Proteomik-Software und führen Sie die Signalextraktion, -identifizierung und -quantifizierung mithilfe eines bibliotheksfreien, datenunabhängigen Erfassungs-Workflows durch.
    1. Verwenden Sie für die Sucheinstellungen die Homo sapiens-Datenbank , spezifische Verdaustypen mit Trypsin/P-Enzymen, 7 minimale Peptidlänge, 52 maximale Peptidlänge, zwei verpasste Spaltungen, Carbamidomethyl als feste Modifikation, Acetylprotein N-Term, Oxidation bei Methionin und Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin (für die Phosphoproteomik-Analyse) als variable Modifikationen und 5 als maximale variable Modifikationen. Legen Sie den FDR-Wert bei PSM, Peptid- und Proteingruppe auf 0,01 fest.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Spectronaut-Software verwendet. Andere DIA-Datensuchsoftware wie DIA-NN und PEAKS werden ebenfalls häufig verwendet. Wenn Daten im DDA-Modus erfasst wurden, sind Software wie MaxQuant und Proteome Discoverer anwendbar.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll demonstriert einen umfassenden Arbeitsablauf von der Isolierung von EVs bis hin zu nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen (Abbildung 1). Die dreifachen Urinproben wurden einer EV-Isolierung unterzogen. Die isolierten EVs wurden mittels Western Blot charakterisiert und anschließend für die massenspektrometriebasierte Proteomik-Probenvorbereitung einschließlich Proteinextraktion, enzymatischer Verdauung und Peptidaufreinigung verarbeitet. Für die Phospho...

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Diskussion

Eine effektive EV-Isolierung ist eine wesentliche Voraussetzung für den Nachweis von Proteinen und Phosphoproteinen mit geringer Häufigkeit in EVs. Trotz der Entwicklung zahlreicher Methoden, um diesen Bedarf zu decken, leidet die Mehrheit immer noch unter Einschränkungen wie schlechter Erholung oder geringer Reproduzierbarkeit, die ihren Einsatz in groß angelegten Studien und klinischen Routineumgebungen behindern. DUC wird im Allgemeinen als die gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Elektrofahrzeugen angesehe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären ein konkurrierendes finanzielles Interesse. Anton Iliuk und W. Andy Tao sind Mitbegründer von Tymora Analytical Operations, einem Unternehmen, das EVtrap-Beads entwickelt und das PolyMAC-Phosphopeptid-Anreicherungskit auf den Markt gebracht hat.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH-Zuschüsse 3RF1AG064250 und R44CA239845 finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeLife Science ProductsM-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1005
15 mL conical centrifuge tubeCorning 352097
15 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074P2
Benchtop incubated shakerBioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAbCell Signaling Technology13403S
ChloroacetamideSigma -AldrichC0267-100GUsed for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate Fisher Scientific E145-4Precipitates detergents
Evosep One EvosepLiquid chromatography system
EvotipsEvosepEV2013Sample loading for Evosep One system 
EVtrapTymora AnalyticalFunctionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF MembraneSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kitTymora AnalyticalPolymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate Sigma -AldrichD6750-10GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate Sigma -AldrichL9150-50GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HTBrukerTrapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips GlygenTT2C18.96Desalting method
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLFor EV elution. 
Triethylammonium bicabonate bufferSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Trifluoroacetic acidSigma -Aldrich302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma -AldrichC4706Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007

Referenzen

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