تصور أحادي الكربوكسيل والمستقلبات الأخرى ذات الصلة في دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار مشفرة وراثيا

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتصور انتقال أحادي الكربوكسيل والجلوكوز و ATP في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا في تحضير دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي .

Abstract

تعد متطلبات الطاقة العالية للأدمغة بسبب النشاط الكهربائي واحدة من أكثر سماتها المميزة. يتم تلبية هذه المتطلبات من خلال إنتاج ATP من الجلوكوز ومستقلباته ، مثل أحادي الكربوكسيل اللاكتات والبيروفات. لا يزال من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العملية أو من هم اللاعبون الرئيسيون ، لا سيما في ذبابة الفاكهة.

باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا ، نقدم طريقة بسيطة لقياس انتقال أحادي الكربوكسيلات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في تحضير يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي . يصف البروتوكول كيفية تشريح ولصق دماغ اليرقات الذي يعبر عن أحد المستشعرات إلى غطاء زجاجي.

نقدم نتائج تجربة كاملة تم فيها قياس نقل اللاكتات في أدمغة اليرقات عن طريق هدم ناقلات الكربوكسيل أحادية الكربوكسيل التي تم تحديدها سابقا في الخلايا الدبقية. علاوة على ذلك ، نوضح كيفية زيادة النشاط العصبي بسرعة وتتبع تغيرات الأيض في الدماغ النشط. يمكن استخدام الطريقة الموصوفة ، والتي توفر جميع المعلومات اللازمة ، لتحليل الأنسجة الحية الأخرى في ذبابة الفاكهة .

Introduction

الدماغ لديه متطلبات طاقة عالية بسبب التكلفة العالية لاستعادة التدرجات الأيونية في الخلايا العصبية الناتجة عن توليد الإشارات الكهربائية العصبية ونقلها ، وكذلك النقل المشبكي ^1,2. يعتقد منذ فترة طويلة أن هذا الطلب المرتفع على الطاقة يتم تلبيته من خلال الأكسدة المستمرة للجلوكوز لإنتاج ATP³. تنقل ناقلات محددة عند الحاجز الدموي الدماغي الجلوكوز في الدم إلى الدماغ. تضمن مستويات نسبة السكر في الدم الثابتة أن يتلقى الدماغ إمدادات ثابتة من الجلوكوز⁴. ومن المثير للاهتمام ، أن الأدلة التجريبية المتزايدة تشير إلى أن الجزيئات المشتقة من استقلاب الجلوكوز ، مثل اللاكتات والبيروف....

Protocol

1. صيانة سلالة الذباب وتزامن اليرقات

1. لإجراء هذه التجارب ، استخدم مزارع الذباب التي يتم تربيتها عند 25 درجة مئوية على طعام ذبابة الفاكهة القياسي المكون من 10٪ خميرة ، 8٪ جلوكوز ، 5٪ دقيق قمح ، 1.1٪ أجار ، 0.6٪ حمض البروبيونيك ، و 1.5٪ ميثيل بارابين.
2. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الأسطر التالية: w¹¹¹⁸ (خلفية التحكم التجريبي) ، OK6-GAL4 (برنامج تشغيل الخلايا العصبية الحركية) ، repo-GAL4 (برنامج تشغيل لجميع الخلايا الدبقية) ، CG-GAL4 (سائق الأجسام الدهنية) ، UAS-Pyronic (مستشعر البيروفات) ، UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (مستشعر الجلوكوز) ، UAS-Laconic (مستشعر اللاكتات) ، UAS-GCaMP6f (مستشعر الكالسيوم) ، ....

النتائج

لمدة تصل إلى 1 ساعة ، يسمح هذا الإجراء بقياس سهل للتغيرات داخل الخلايا في مضان مستشعرات أحادي الكربوكسيل والجلوكوز. كما هو موضح في الشكل 4 ، تستجيب المستشعرات المقتضبة في كل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الحركية لاكتات 1 mM بمعدل مماثل في بداية النبضة ، لكن الخلايا الع?.......

Discussion

يعد استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لدراسة استقلاب الدماغ جديدا نسبيا²⁶ ، وقد ثبت أنه يشترك في خصائص أكثر مع استقلاب الثدييات مما كان متوقعا ، والذي تمت دراسته بشكل أساسي في المختبر في مزارع الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ. تتفوق ذبابة الفاكهة في التجارب ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-