Визуализация монокарбоксилатов и других соответствующих метаболитов в головном мозге личинок дрозофилы ex vivo с помощью генетически закодированных сенсоров

Резюме

Здесь мы представляем протокол визуализации транспорта монокарбоксилатов, глюкозы и АТФ в глиальных клетках и нейронах с использованием генетически закодированных датчиков резонансной передачи энергии Фёрстера в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo .

Аннотация

Высокая потребность мозга в энергии из-за электрической активности является одной из его наиболее отличительных особенностей. Этим требованиям удовлетворяет производство АТФ из глюкозы и ее метаболитов, таких как монокарбоксилаты лактат и пируват. До сих пор неясно, как регулируется этот процесс и кто является ключевыми игроками, особенно в случае с дрозофилами.

Используя генетически закодированные датчики переноса энергии резонанса Фёрстера, мы представляем простой метод измерения транспорта монокарбоксилатов и глюкозы в глиальных клетках и нейронах в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo . Протокол описывает, как препарировать и прикрепить мозг личинки, экспрессирующий один из датчиков, к стеклянному покровному стеклу.

Мы представляем результаты целого эксперимента, в котором транспорт лактата измерялся в мозге личинок путем сбивания ранее идентифицированных монокарбоксилатных транспортеров в глиальных клетках. Кроме того, мы демонстрируем, как быстро повысить нейронную активность и отслеживать метаболитные изменения в активном мозге. Описанный метод, дающий всю необходимую информацию, может быть использован для анализа других живых тканей дрозофилы .

Введение

Мозг предъявляет высокие потребности в энергии из-за высоких затрат на восстановление ионных градиентов в нейронах, вызванных генерацией и передачей нейрональных электрических сигналов, а также синаптической передачей ^1,2. Долгое время считалось, что эта высокая потребность в энергии удовлетворяется за счет непрерывного окисления глюкозы с образованием^АТФ3. Специфические транспортеры на гематоэнцефалическом барьере переносят глюкозу из крови в мозг. Постоянный уровень гликемии гарантирует, что мозг получает стабильное поступление глюкозы⁴. Интересно, что растущее....

протокол

1. Поддержание штамма мух и синхронизация личинок

1. Для проведения этих экспериментов использовали культуры мух, выращенные при температуре 25 °C, на стандартном корме дрозофилы , состоящем из 10% дрожжей, 8% глюкозы, 5% пшеничной муки, 1,1% агара, 0,6% пропионовой кислоты и 1,5% метилпарабена.
2. Для следования этому протоколу используйте следующие строки: w¹¹¹⁸ (экспериментальный контрольный фон), OK6-GAL4 (драйвер для двигательных нейронов), repo-GAL4 (драйвер для всех глиальных клеток), CG-GAL4 (драйвер для жировых тел), UAS-Pyronic (пируватный датчик), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (датчик глюкозы), U....

Результаты

В течение 1 ч эта процедура позволяет легко измерять внутриклеточные изменения флуоресценции монокарбоксилатных и глюкозных сенсоров. Как показано на рисунке 4, лаконичные сенсоры как в глиальных клетках, так и в двигательных нейронах реагируют на лактат 1 мМ с одинаков.......

Обсуждение

Использование модели дрозофилы для изучения метаболизма мозга является^{относительно новым}, и было показано, что она имеет больше общих характеристик с метаболизмом млекопитающих, чем ожидалось, который в основном изучался in vitro в культурах первичных нейронов или.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-