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요약

여기에서는 생체 외 초파리 유충 뇌 제제에서 유전적으로 인코딩된 Förster 공명 에너지 전달 기반 센서를 사용하여 신경교세포와 뉴런에서 모노카르복실레이트, 포도당 및 ATP의 수송을 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

전기 활동으로 인한 뇌의 높은 에너지 요구량은 가장 두드러진 특징 중 하나입니다. 이러한 요구 사항은 포도당과 모노카르복실레이트 젖산염 및 피루브산과 같은 대사 산물에서 ATP를 생성함으로써 충족됩니다. 이 과정이 어떻게 규제되는지, 특히 초파리의 핵심 주체가 누구인지는 아직 불분명합니다.

유전적으로 인코딩된 Förster 공명 에너지 전달 기반 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌 제제에서 신경교세포와 뉴런에서 모노카르복실레이트와 포도당의 수송을 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 센서 중 하나를 발현하는 유충 뇌를 해부하고 유리 커버슬립에 부착하는 방법을 설명합니다.

우리는 신경교세포에서 이전에 확인된 모노카르복실레이트 수송체를 쓰러뜨려 유충 뇌에서 젖산 수송을 측정한 전체 실험의 결과를 제시합니다. 또한 신경 활동을 빠르게 증가시키고 활성 뇌의 대사 산물 변화를 추적하는 방법을 보여줍니다. 필요한 모든 정보를 제공하는 설명된 방법은 다른 초파리 생체 조직을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

뇌는 시냅스 전달뿐만 아니라 뉴런의 전기 신호 생성 및 전달로 인한 뉴런의 이온 구배를 복원하는 데 많은 비용이 들기 때문에 높은 에너지 요구량을 가지고 있습니다 1,2. 이 높은 에너지 수요는 ATP3를 생성하기 위해 포도당의 지속적인 산화에 의해 충족되는 것으로 오랫동안 생각되어 왔습니다. 혈액-뇌 장벽의 특정 수송체는 혈액 속의 포도당을 뇌로 전달합니다. 혈당 수치가 일정하면 뇌가 포도당을 꾸준히 공급받을 수 있습니다4. 흥미롭게도, 젖산염 및 피루브산과 같은 포도당 대사에서 파생된 분자가 뇌 세포의 에너지 생산에 중요한 역할을 한다는 실험적 증거가 증가하고 있습니다 5,6. 그러나 이러한 분자가 에너지 생산에 얼마나 중요한지, 뇌의 어떤 세포가 생성하거나 사용하는지에 대한 논쟁이 여전히 있습니다 7,8. 이 작업에 필요한 높은 시간적, 공간적 해상도를 가진 적절한 분자 도구의 부족은 이 논란을 완전히 해결하지 못하게 하는 중요한 문제입니다.

여러 가지 설계된 형광 대사 센서의 개발 및 적용은 대사 산물이 어디에서 어떻게 생산되고 사용되는지, 그리고 기초 및 높은 신경 활동 동안 대사 흐름이 어떻게 발생하는지에 대한 이해를 현저하게 증가시켰습니다9. ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucose), Laconic (젖산염) 및 Pyronic (pyruvate)과 같은 Förster 공명 에너지 전달 (FRET) 현미경을 기반으로 유전적으로 인코딩 된 대사 센서는 뇌 에너지 대사에 대한 우리의 이해에 기여했습니다 10,11,12,13. 그러나 살아있는 동물이나 조직에 대한 실험을 수행하는 데 필요한 높은 비용과 정교한 장비로 인해 척추동물 모델의 결과는 여전히 주로 세포 배양(신경교세포 및 뉴런)으로 제한됩니다.

이러한 센서를 발현하기 위해 초파리 모델을 새롭게 사용함에 따라 주요 대사 기능이 종 간에 보존되고 이 도구로 그 기능을 쉽게 해결할 수 있음이 밝혀졌습니다. 더 중요한 것은 초파리 모델이 포도당과 젖산/피루브산이 파리의 뇌에서 어떻게 운반되고 대사되는지, 모노카르복실레이트 소비와 기억 형성 사이의 연관성, 신경 활동과 대사 흐름의 증가가 어떻게 겹치는지에 대한 놀라운 입증을 밝혔다는 것입니다 14,15,16,17. 유충 뇌에서 발현되는 유전적으로 인코딩된 FRET 센서를 사용하여 모노카르복실레이트, 포도당 및 ATP 수준을 측정하기 위해 여기에 제시된 방법을 통해 연구자들은 초파리의 뇌가 다른 동물의 뇌에 적용할 수 있는 에너지를 사용하는 방법에 대해 더 많이 배울 수 있습니다.

우리는 이 방법이 신경교세포와 뉴런에서 젖산과 포도당을 검출하는 데 효과적이며, 모노카르복실레이트 수송체(Chaski)가 신경교세포로의 젖산염 가져오기에 관여한다는 것을 보여줍니다. 또한 GABAA 수용체 길항제의 목욕 적용으로 쉽게 유도할 수 있는 신경 활동 증가 중 대사 산물 변화를 연구하는 간단한 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 이 방법론이 지방체와 같은 다른 대사적으로 중요한 조직에서 모노카르복실레이트 및 포도당 수송을 측정하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

1. 파리 균주 유지 및 유충 동기화

  1. 이러한 실험을 수행하기 위해 10% 효모, 8% 포도당, 5% 밀가루, 1.1% 한천, 0.6% 프로피온산 및 1.5% 메틸파라벤으로 구성된 표준 초파리 식품에 대해 25°C에서 올린 파리 배양액을 사용합니다.
  2. 이 프로토콜을 따르려면 w1118 (실험 대조군 배경), OK6-GAL4 (운동 뉴런용 드라이버), repo-GAL4 (모든 신경교세포용 드라이버), CG-GAL4 (지방체용 드라이버), UAS-Pyronic (피루브산 센서), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (포도당 센서), UAS-Laconic (젖산 센서), UAS-GCaMP6f (칼슘 센서), UAS-AT1.03NL (ATP 센서) 및 UAS-Chk RNAi GD1829. 센서 또는 RNAi를 발현하는 모든 계통은 w1118 유전적 배경에 있습니다.
  3. 동기화된 세 번째 인스타 방랑 유충을 얻으려면 원하는 유전적 교배의 파리 300마리(생후 3-5일, 수컷 100마리, 처녀 암컷 200마리)를 인산염 완충 식염수(PBS)에 1% 아가로스로 덮인 60mm 페트리 접시가 들어 있는 알을 낳는 챔버에 넣습니다. 플라크 중앙에 액체/크림 효모(직경 1.5cm) 한 방울을 떨어뜨려 파리가 알을 낳도록 합니다(그림 1).
  4. 파리를 25 °C에서 3 일 동안 유지하고 아가로스 페트리 접시를 신선한 접시와 갓 녹인 효모로 하루에 두 번 교체하십시오.
  5. 페트리 접시를 바꾸기 전에 파리가 4 시간 동안 알을 낳도록하십시오. 이 플라크를 제거하십시오. 그런 다음 3시간 동안 파리가 갓 녹인 효모가 있는 새로운 아가로스 플라크에 알을 낳도록 합니다. 이 유충을 실험에 사용하십시오.
  6. 3시간 후 계란이 들어 있는 플라크를 제거하고 25°C 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.
  7. 이 플라크에서 새로 부화한 유충 50-100마리를 수집하여(유충 부화 후 0시간) 표준 먹이가 들어 있는 플라스틱 유리병에 넣습니다. 유충이 제대로 먹을 수 있도록 음식이 갈리고 부드러워야 합니다. 이동 후 96시간 후에 유충을 사용하십시오.

2. 폴리-L-라이신으로 유리 커버슬립을 만듭니다.

  1. 유충 해부 1시간 전에 이 단계를 수행합니다. 6웰 세포 배양 플레이트에 25mm 유리 커버슬립을 놓습니다(사용할 커버의 직경은 현미경에서 사용할 수 있는 기록 챔버에 따라 다름).
  2. 폴리-L-라이신 한 방울(300μL)을 실온에서 30분 동안 각 커버슬립 중앙에 놓습니다.
  3. 각 커버슬립을 증류수로 3번 세척한 다음Ca2+ 가 없는 식염수로 2번 세척합니다(유충을 해부하는 데 사용된 것과 동일한 용액, 3.2단계 참조). 기록 챔버에 커버를 설치하고 Ca2+가 없는 식염수로 채웁니다.
    참고: 유충 뇌는 유리 커버슬립에 직접 부착할 수 있지만 접착력이 약하고 식염수의 지속적인 흐름으로 인해 실험 중에 뇌가 때때로 움직이거나 변위됩니다. 폴리-L-라이신 단계를 추가하면 세척으로 인한 움직임 또는 뇌 손실의 위험이 줄어듭니다.

3. 복부 신경삭(VNC)과 지방체(FB)를 절개합니다.

  1. 원하는 유전자 교배(1.7단계)에서 방황하는 세 번째 인스타 유충을 수집하고 증류수로 3배 철저히 씻습니다.
  2. 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM 트레할로스, 5 mM HEPES 및 35 mM 자당으로 구성된 750 μL의 공칭 제로 Ca2+ 얼음 냉수 식염수(pH = 6.7, pH 측정기로 측정하고 1 M NaOH 및 HCl 37% v/v로 조정)로 구성된 유리 해부 접시에 유충을 넣습니다.
    참고: pH를 6.7로 설정하는 것은 이전에 관찰한 바와 같이 모노카르복실레이트 수송이 용액의 pH에 크게 의존하기 때문에 매우 중요합니다. 또한, 6.7은 제 3 인스타 유충17,18의 혈림프에서의 pH에 해당한다.
  3. 유충을 실체현미경 아래에 놓고 한 쌍의 집게로 복부 뒤쪽을 가로질러 가로로 자릅니다.
  4. 집게로 턱을 밀면서 유충을 뒤집습니다.
  5. 턱 옆에 있는 복부 신경삭(VNC)을 관찰합니다. 상상 디스크와 남아 있는 뇌-꼬리 조직을 조심스럽게 제거합니다.
  6. 신경을 절단하여 중추 뇌 및 시신경이 있는 VNC를 나머지 조직과 분리합니다. VNC를 옮겨 나머지 신경에서 집게로 집어 들고 Ca2+-free 기록 용액(3.2단계와 동일한 용액)이 들어 있는 기록 챔버에 넣습니다. VNC는 즉시 커버슬립에 부착됩니다.
  7. 나머지 신경의 간섭을 피하려면 집게를 사용하여 커버슬립 바닥에 부착합니다(신경은 사용된 드라이버 라인에 따라 형광성이기도 함)(그림 2).
  8. 다른 실험 세트에서 포도당 또는 모노카르복실레이트 수송을 측정하는 지방체(FB)에서 실험을 수행하려면 3.1-3.4단계에 따라 조직 분리를 진행합니다. 유충이 뒤집히면 FB가 흰색의 양측성 편평한 조직임을 관찰합니다.
  9. FRET 센서(적절한 드라이버를 사용하여 유전자 교차에서 획득)를 발현하는 분리된 FB를 Ca2+가 없는 기록 용액이 들어 있는 기록 챔버에 넣습니다.
    알림: FB는 소수성이 높고(용액 표면에 뜨는 경향이 있음) 겸자를 사용한 조작에 매우 취약하므로 주의해서 다루어야 합니다. 이 조직을 거칠게 다루면 나중에 죽은 세포가 생성됩니다(센서의 형광 감소).
  10. VNC/FB가 포함된 기록 챔버를 현미경 s에 놓습니다.tag이자형.

4. 살아있는 세포 화상 진찰

  1. 조직 발현 센서의 이미지를 획득하려면 방출 분할 시스템 및 CCD 카메라에 결합된 정립 형광 현미경을 사용합니다. 실험을 시작하기 30분 전에 현미경의 조명 시스템을 켜십시오.
    참고: 여기서는 20x/0.5 Water Immersion Objective가 장착된 Spinning Disk 형광 현미경을 사용하여 VNC와 FB를 모두 관찰합니다. 그림 2 는 40x/0.8 Water Immersion Objective의 사용도 보여줍니다.
  2. GCaMP6f 형광을 시각화하려면 여기 파장과 방출 파장을 각각 488nm 와 540nm로 설정합니다. Laconic/Pyronic/ATP/glucose 센서의 경우 여기 파장을 440nm 로, 방출 파장을 488nm (mTFP, CFP) 및 540nm (Venus, YFP)로 설정합니다.
  3. GCaMP6f의 경우 2초마다, Laconic/Pyronic/ATP/포도당 센서의 경우 10-30초마다 512 x 512 픽셀 크기의 이미지를 획득합니다. 광원에 대한 최적의 노출을 결정하여 얻은 이미지의 품질을 관찰합니다. 이 프로토콜을 따르려면 이미지가 Laconic 및 Pyronic 센서의 경우 300ms, 포도당 및 ATP 센서의 경우 100-150ms인지 확인하십시오.
    알림: 노출은 컨포칼 또는 일반 형광 현미경의 사용에 따라 달라질 수 있습니다.
  4. 기록 챔버가 s에 설치되면tage 현미경의 경우 물 침지 대물렌즈를 조심스럽게 놓고 대물렌즈가 실험 내내 물속에 잠겨 있는지 확인합니다. 실내 온도를 25°C로 유지하십시오.
  5. 기록 챔버를 관류 시스템에 연결하고 128mM NaCl, 2mM KCl, 1.5mMCaCl2, 4mMMgCl2, 5mM 트레할로스, 5mM HEPES 및 35mM 자당, pH 6.7(pH 측정기로 측정하고 NaOH 및 HCl로 조정)을 포함하는 기록 용액에 조직을 목욕된 상태로 유지합니다.
  6. 부피를 일정하게 유지하면서 챔버에서 액체를 추출하기 위해 저플럭스 연동 펌프에 결합된 중력을 사용하여 조직을 통해 3mL/분의 기록 용액을 일정하게 유지합니다. 필요한 유량을 얻으려면 용액 함유 튜브(50mL 플라스틱 튜브)를 현미경 스테이지에서 25cm 위에 배치합니다.
    참고: 이 중력 구동 흐름은 연동 펌프로 인한 조직 이동을 방지하는 데 사용되어 나중에 보다 정확한 이미지 분석을 가능하게 합니다.
  7. 자극을 가하기 전에 센서에서 안정적인 형광 기준선을 얻기 위해 기록 용액을 5-10분 동안 흐르게 유지하십시오. 이 기준선을 얻기 위해 필요에 따라 기간을 변경합니다.
  8. VNC/FB를 자극하기 위해 5분 동안 유동 용액을 자극 용액으로 교체합니다(식염수에 용해된 각 실험에 대해 설명된 농도의 포도당, 피루브산 또는 젖산염 사용, 각 그림 참조).
    참고: 자극 지속 시간은 실험의 필요에 따라 달라질 수 있습니다(예를 들어, 이전에 보고된 바와 같이 포도당 맥박을 10분으로 증가시켜 뉴런의 정체기에 도달할 수 있음16).
  9. 자극 용액에서 삼투압을 유지하려면 첨가된 모노카르복실레이트 또는 포도당의 농도에 따라 자당 농도( 초파리 뇌에 의해 대사되지 않는 탄수화물)를 수정하십시오.
  10. 간단한 밸브 시스템을 사용하여 솔루션을 변경하십시오. 현미경을 움직이지 않도록 주의하십시오.tag이자형.
  11. VNC를 80μM 피크로톡신(PTX, 연속 유동)에 노출시켜 신경 활동을 자극합니다. 이 절차는 Ca2+ 진동의 빈도를 증가시켜 대사 관련 분자(예: 세포 내 ATP)의 변화를 관찰할 수 있도록 합니다.
  12. 실험이 끝나면 튜브와 기록 챔버를 포함한 전체 흐름 시스템을 식염수로 최소 10분, 증류수로 10분 더 철저히 세척하여 사용된 용액의 흔적을 제거합니다.

5. 이미지 처리 및 데이터 분석

  1. 얻은 이미지를 처리하려면 그림 3에 표시된 단계를 진행하십시오.
  2. 이미지(Laconic)를 ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다. 이미지에는 샘플에 대한 두 가지 보기가 있는데, 왼쪽은 mTFP 신호이고 오른쪽은 금성 신호입니다. 분석할 세포가 포함된 영역을 선택하고 이러한 이미지(mTFP 및 금성)를 새 창에서 분리합니다. 이러한 이미지에 정확히 동일한 영역이 포함되어 있는지 확인합니다.
  3. 정합 플러그인을 열고 함수 강체를 사용한 실험에서 일반적으로 관찰되는 조직의 작은 드리프트를 수정합니다. 두 이미지(mTFP 및 금성)에서 이 작업을 수행합니다.
  4. mTFP 신호(488nm)에서 대응하는 10개 세포의 세포질에서 최소 10개의 관심 영역(ROI)을 선택하고 선택 항목을 금성(540nm) 이미지로 전송합니다.
  5. 분석 중인 세포에 가깝지만 식별 가능한 신호가 없는 2개 또는 3개의 ROI를 선택합니다(항상 분석된 VNC 또는 조직 내, 그림 3 참조). 이것이 배경 ROI입니다.
  6. 두 영상에서 ROI를 선택한 상태에서 함수 measure를 사용하여 각 신호의 평균 회색 값을 구합니다. 데이터를 데이터시트로 전송하고 각 신호의 평균 백그라운드 값을 뺍니다.
  7. 금성에 대한 mTFP 형광 비율을 결정합니다(Laconic 및 Pyronic의 경우). 이 값은 여기에 설명된 다른 FRET 센서(비율이 일반적으로 YFP/CFP인 경우)와 다르게 계산되는데, 이는 각각의 기판에 결합할 때 Laconic 및 Pyronic 모두 FRET 효율을 감소시키기 때문입니다.
  8. 기록된 각 값을 기준선으로 나누어 데이터를 정규화합니다. 별도의 데이터 시트에서 자극 전 2분 동안 mTFP/Venus 비율의 평균값을 취하여 기준선을 계산합니다.
  9. FRET 기반 센서를 사용한 포도당 및 ATP 측정의 경우 YFP/CFP 비율을 계산하고 5.8단계에 설명된 대로 데이터를 정규화합니다.

결과

최대 1시간 동안 이 절차를 통해 모노카르복실레이트 및 포도당 센서의 형광에서 세포 내 변화를 쉽게 측정할 수 있습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 신경교세포와 운동 뉴런 모두의 Laconic 센서는 펄스 시작 시 비슷한 속도로 1mM 젖산에 반응하지만, 운동 뉴런은 앞서 설명한 바와 같이 5분 펄스 동안 기준선보다 더 높은 증가에 도달합니다17. 이 젖산 농도는 ?...

토론

뇌 대사 연구를 위한 초파리 모델의 사용은 비교적 새로운 것으로26 포유류 대사와 예상보다 더 많은 특성을 공유하는 것으로 나타났으며, 이는 주로 1차 뉴런 배양 또는 뇌 절편에서 시험관 내에서 연구되었습니다. 초파리 는 유전 도구와 유전적으로 인코딩된 센서의 배터리 덕분에 생체 내 실험에 탁월하며, 이를 통해 연구자들은 유도된 활동 또는 감...

공개

저자는 경쟁 또는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 말

Sierralta Lab의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 FONDECYT-Iniciación 11200477(AGG로) 및 FONDECYT Regular 1210586(JS로)의 지원을 받았습니다. UAS-FLII12Pglu700μδ6(포도당 센서)은 CNRS-Paris의 Pierre-Yves Plaçais와 Thomas Preat가 친절하게 기증했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigmaA9539
CaCl2SigmaC3881
CCD Camera ORCA-R2Hamamatsu-
Cell-R SoftwareOlympus-
CG-GAL4Bloomington Drosophila Stock Center7011Fat body driver
Dumont # 5 ForcepsFine Science Tools11252-30
DV2-emission splitting systemPhotometrics-
Glass coverslips (25 mm diameter)Marienfeld111650Germany
GlucoseSigmaG8270
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 8,0,2
HEPESSigmaH3375
ImageJ softwareNational Institues of HealthVersion 1,53t
KClSigmaP9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objectiveOlympus-
MethylparabenSigmaH5501
MgCl2SigmaM1028
NaClSigmaS7653
OK6-GAL4Bloomington Drosophila Stock CenterMotor neuron driver
PicrotoxinSigmaP1675SCAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysineSigmaP4707
Propionic AcidSigmaP1386
Repo-GAL4Bloomington Drosophila Stock Center7415Glial cell driver (all)
Sodium LactateSigma71718
Sodium pyruvateSigmaP2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WIOlympus-
SucroseSigmaS0389
TrehaloseUS BiologicalT8270
UAS-AT1.03NL Kyoto Drosophila Stock Center117012ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829Vienna Drosophila Resource Centerv37139Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6 Bloomington Drosophila Stock Center93452Glucose sensor
UAS-GCaMP6f Bloomington Drosophila Stock Center42747Calcium sensor
UAS-LaconicSierralta Lab-Lactate sensor
UAS-PyronicPierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objectiveOlympus-

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