Visualisation des monocarboxylates et d’autres métabolites pertinents dans le cerveau larvaire de la drosophile ex vivo à l’aide de capteurs génétiquement codés

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour visualiser le transport des monocarboxylates, du glucose et de l’ATP dans les cellules gliales et les neurones à l’aide de capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés dans une préparation cérébrale ex-vivo de larves de drosophile .

Résumé

Les besoins énergétiques élevés du cerveau dus à l’activité électrique sont l’une de leurs caractéristiques les plus distinctives. Ces besoins sont satisfaits par la production d’ATP à partir du glucose et de ses métabolites, tels que les monocarboxylates lactate et pyruvate. On ne sait toujours pas comment ce processus est réglementé ni qui en sont les principaux acteurs, en particulier chez la drosophile.

En utilisant des capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés, nous présentons une méthode simple pour mesurer le transport des monocarboxylates et du glucose dans les cellules gliales et les neurones dans une préparation ex-vivo du cerveau larvaire de la drosophile . Le protocole décrit comment disséquer et coller un cerveau larvaire exprimant l’un des capteurs à une lamelle en verre.

Nous présentons les résultats d’une expérience complète dans laquelle le transport du lactate a été mesuré dans le cerveau des larves en neutralisant des transporteurs de monocarboxylate précédemment identifiés dans les cellules gliales. De plus, nous démontrons comment augmenter rapidement l’activité neuronale et suivre les changements de métabolites dans le cerveau actif. La méthode décrite, qui fournit toutes les informations nécessaires, peut être utilisée pour analyser d’autres tissus vivants de la drosophile .

Introduction

Le cerveau a des besoins énergétiques élevés en raison du coût élevé de la restauration des gradients ioniques dans les neurones causés par la génération et la transmission du signal électrique neuronal, ainsi que par la transmission synaptique ^1,2. On a longtemps pensé que cette forte demande énergétique était satisfaite par l’oxydation continue du glucose pour produire de l’ATP³. Des transporteurs spécifiques à la barrière hémato-encéphalique transfèrent le glucose dans le sang vers le cerveau. Des niveaux glycémiques constants garantissent que le cerveau reçoit un apport constant de glucose⁴. Il est intéressant de noter que de plus en plus de preuves expérimentales suggèrent que les molécules dérivées du métabolisme du glucose, telles que le lactate et le pyruvate, jouent un rôle important dans la production d’énergie des cellules cérébrales ^5,6. Cependant, il y a encore un débat sur l’importance de ces molécules pour la production d’énergie et sur les cellules du cerveau qui les produisent ou les utilisent ^7,8. Le manque d’outils moléculaires appropriés avec la haute résolution temporelle et spatiale requise pour cette tâche est un problème important qui a empêché cette controverse d’être complètement résolue.

Le développement et l’application de plusieurs capteurs métaboliques fluorescents ont permis d’améliorer considérablement notre compréhension de l’endroit et de la manière dont les métabolites sont produits et utilisés, ainsi que de la façon dont les flux métaboliques se produisent pendant l’activité neuronale basale et élevée⁹. Des capteurs métaboliques génétiquement codés basés sur la microscopie à transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET), tels que ATeam (ATP), FLII¹²Pglu700μδ6 (glucose), Laconic (lactate) et Pyronic (pyruvate), ont contribué à notre compréhension du métabolisme énergétique cérébral 10,11,12,13. Cependant, en raison des coûts élevés et de l’équipement sophistiqué requis pour mener des expériences sur des animaux vivants ou des tissus, les résultats des modèles de vertébrés sont encore principalement limités aux cultures cellulaires (cellules gliales et neurones).

L’utilisation émergente du modèle de la drosophile pour exprimer ces capteurs a révélé que les caractéristiques métaboliques clés sont conservées à travers les espèces et que leur fonction peut être facilement traitée avec cet outil. Plus important encore, le modèle de la drosophile a mis en lumière la façon dont le glucose et le lactate/pyruvate sont transportés et métabolisés dans le cerveau de la mouche, le lien entre la consommation de monocarboxylate et la formation de la mémoire, et la démonstration remarquable de la façon dont les augmentations de l’activité neuronale et du flux métabolique se chevauchent 14,15,16,17. La méthode présentée ici pour mesurer les niveaux de monocarboxylate, de glucose et d’ATP à l’aide de capteurs FRET génétiquement codés exprimés dans le cerveau larvaire permet aux chercheurs d’en savoir plus sur la façon dont le cerveau de la drosophile utilise l’énergie, qui peut être appliquée au cerveau d’autres animaux.

Nous montrons que cette méthode est efficace pour détecter le lactate et le glucose dans les cellules gliales et les neurones, et qu’un transporteur de monocarboxylate (Chaski) est impliqué dans l’importation du lactate dans les cellules gliales. Nous démontrons également une méthode simple pour étudier les changements de métabolites lors d’une activité neuronale accrue, qui peut être facilement induite par l’application d’un antagoniste du récepteur GABA_A . Enfin, nous montrons que cette méthodologie peut être utilisée pour mesurer le transport du monocarboxylate et du glucose dans d’autres tissus métaboliquement significatifs, tels que les corps adipeux.

Protocole

1. Entretien de la souche de mouche et synchronisation larvaire

1. Pour réaliser ces expériences, utilisez des cultures de mouches élevées à 25 °C sur des aliments standard pour drosophiles composés de 10 % de levure, 8 % de glucose, 5 % de farine de blé, 1,1 % de gélose, 0,6 % d’acide propionique et 1,5 % de méthylparabène.
2. Pour suivre ce protocole, utilisez les lignes suivantes : w¹¹¹⁸ (fond de contrôle expérimental), OK6-GAL4 (pilote pour les motoneurones), repo-GAL4 (pilote pour toutes les cellules gliales), CG-GAL4 (pilote pour les corps adipeux), UAS-Pyronic (capteur de pyruvate), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (capteur de glucose), UAS-Laconic (capteur de lactate), UAS-GCaMP6f (capteur de calcium), UAS-AT1.03NL (capteur d’ATP) et UAS-Chk RNAi GD1829. Toutes les lignées exprimant des capteurs ou ARNi sont dans le fond génétique w¹¹¹⁸ .
3. Pour obtenir des larves errantes synchronisées au troisième stade, placez 300 mouches (âgées de 3 à 5 jours, 100 mâles, 200 femelles vierges) du croisement génétique souhaité dans la chambre de ponte, qui contient une boîte de Pétri de 60 mm recouverte d’agarose à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placez une goutte de levure liquide/crémeuse (1,5 cm de diamètre) au centre de la plaque pour encourager les mouches à pondre des œufs (Figure 1).
4. Maintenez les mouches à 25 °C pendant 3 jours en remplaçant la boîte de Pétri d’agarose par une fraîche et de la levure fraîchement dissoute deux fois par jour.
5. Laissez les mouches pondre pendant 4 h le quatrième jour avant de changer la boîte de Pétri. Retirez cette plaque. Ensuite, pendant 3 h, laissez les mouches pondre dans une nouvelle plaque d’agarose avec de la levure fraîchement dissoute. Utilisez ces larves dans les expériences.
6. Après 3 h, retirez la plaque contenant les œufs et placez-la dans un incubateur à 25 °C pendant 24 h.
7. Prélevez 50 à 100 larves nouvellement écloses de cette plaque (0 h après l’éclosion des larves) et placez-les dans un flacon en plastique contenant de la nourriture standard. Pour permettre aux larves de se nourrir correctement, assurez-vous que la nourriture est moulue et molle. Utiliser les larves 96 h après le transfert.

2. Fabriquer les lamelles en verre avec de la poly-L-lysine

1. Effectuez cette étape 1 h avant la dissection larvaire. Dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits, placer des lamelles en verre de 25 mm (le diamètre des couvercles à utiliser dépend de la chambre d’enregistrement disponible au microscope).
2. Placer une goutte (300 μL) de poly-L-lysine au centre de chaque lamelle pendant 30 min à température ambiante.
3. Lavez chaque lamelle 3x avec de l’eau distillée, puis 2x avec une solution saline dépourvue de Ca²⁺ (la même solution utilisée pour disséquer les larves, voir étape 3.2). Installez les couvercles dans la chambre d’enregistrement et remplissez-la de solution saline sans Ca²⁺.
   REMARQUE : Bien que le cerveau larvaire puisse adhérer directement aux lamelles de verre, l’adhérence est faible et le cerveau bouge ou se déplace occasionnellement pendant l’expérience en raison du flux continu de solution saline. L’ajout de l’étape poly-L-lysine réduit le risque de mouvements ou même de perte de cerveau à la suite des lavages.

3. Disséquer le cordon nerveux ventral (VNC) et les corps adipeux (FB)

1. Rassemblez les larves errantes du troisième stade du croisement génétique souhaité (à partir de l’étape 1.7) et lavez-les soigneusement 3 fois avec de l’eau distillée.
2. Placer les larves dans un puits de dissection en verre contenant 750 μL de solution saline glacée Ca²⁺ nominalement nulle composée de 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl₂, 5 mM de tréhalose, 5 mM HEPES et 35 mM de saccharose (pH = 6,7, mesuré avec un pH-mètre et ajusté avec 1 M de NaOH et HCl 37 % v/v).
   REMARQUE : Il est essentiel de régler le pH à 6,7 car, comme nous l’avons déjà observé, le transport des monocarboxylates dépend fortement du pH de la solution. De plus, 6,7 correspond au pH dans l’hémolymphe d’une larve du troisième stade ^17,18.
3. Placez la larve sous un stéréomicroscope et faites une coupe transversale à l’arrière de l’abdomen avec une paire de pinces.
4. Poussez la mâchoire avec la pince tout en retournant les larves.
5. Observez le cordon nerveux ventral (VNC) à côté de la mâchoire. Retirez soigneusement les disques imaginaux et les tissus caudaux restants.
6. Séparez le VNC avec le cerveau central et les lobes optiques du reste du tissu en coupant les nerfs. Transférez le VNC, en le prenant avec une pince sur les nerfs restants, et en le plaçant dans la chambre d’enregistrement contenant la solution d’enregistrement sans Ca²⁺ (même solution que l’étape 3.2). Les VNC adhéreront immédiatement aux lamelles.
7. Pour éviter toute interférence avec les nerfs restants, fixez-les au bas de la lamelle à l’aide d’une pince (les nerfs seront également fluorescents selon la ligne de pilote utilisée) (Figure 2).
8. Pour effectuer des expériences sur des corps adipeux mesurant le transport du glucose ou du monocarboxylate dans une autre série d’expériences, procédez à l’isolement des tissus en suivant les étapes 3.1-3.4. Une fois les larves retournées, observez que le FB est un tissu blanc, bilatéral et plat.
9. Placer les FB isolés exprimant les capteurs FRET (obtenus à partir d’un croisement génétique à l’aide des pilotes appropriés) dans la chambre d’enregistrement contenant la solution d’enregistrement sans Ca²⁺.
   REMARQUE : Le FB est très hydrophobe (il a tendance à flotter à la surface de la solution) et extrêmement vulnérable à la manipulation avec des pinces, il doit être manipulé avec précaution. Toute manipulation brutale de ce tissu entraînera des cellules mortes plus tard (avec une diminution de la fluorescence des capteurs).
10. Placez la chambre d’enregistrement contenant les VNC/FB sur la platine du microscope.

4. Imagerie de cellules vivantes

1. Pour acquérir des images des capteurs d’expression tissulaire, utilisez un microscope à fluorescence vertical couplé à un système de division d’émission et à une caméra CCD. Allumez le système d’éclairage du microscope 30 minutes avant de commencer toute expérience.
   REMARQUE : Ici, nous utilisons un microscope à fluorescence à disque rotatif équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x/0,5 pour observer à la fois les VNC et les FB. La figure 2 montre également l’utilisation d’un objectif d’immersion dans l’eau 40x/0,8.
2. Pour visualiser la fluorescence GCaMP6f, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 488 nm et 540 nm, respectivement. Pour les capteurs laconiques/pyroniques/ATP/glucose, réglez la longueur d’onde d’excitation à 440 nm et les longueurs d’onde d’émission à 488 nm (mTFP, CFP) et 540 nm (Venus, YFP).
3. Acquérez des images de 512 x 512 pixels toutes les 2 s pour GCaMP6f et toutes les 10-30 s pour les capteurs laconiques/pyroniques/ATP/glucose. Déterminer l’exposition optimale à la source lumineuse en observant la qualité de l’image obtenue. Pour suivre ce protocole, assurez-vous que les images sont de 300 ms d’exposition pour les capteurs laconiques et pyroniques et de 100-150 ms pour les capteurs de glucose et d’ATP .
   REMARQUE : L’exposition peut varier en fonction de l’utilisation d’un microscope confocal ou à fluorescence normale.
4. Une fois la chambre d’enregistrement installée dans la platine du microscope, placez soigneusement l’objectif d’immersion dans l’eau et assurez-vous que l’objectif reste immergé tout au long de l’expérience. Maintenez la température ambiante à 25 °C.
5. Raccorder la chambre d’enregistrement à un système de perfusion et maintenir les tissus baignés dans la solution d’enregistrement contenant 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂, 4 mM de MgCl₂, 5 mM de tréhalose, 5 mM d’HEPES et 35 mM de saccharose, pH 6,7 (mesuré avec un pH-mètre et ajusté avec du NaOH et du HCl).
6. Maintenir un débit constant de 3 mL/min de solution d’enregistrement à travers le tissu en utilisant la gravité, couplée à une pompe péristaltique à faible flux pour extraire le liquide de la chambre tout en maintenant le volume constant. Pour obtenir le débit requis, placez les tubes contenant la solution (tubes en plastique de 50 ml) à 25 cm au-dessus de la platine du microscope.
   REMARQUE : Cet écoulement par gravité est utilisé pour empêcher le mouvement des tissus causé par les pompes péristaltiques, permettant une analyse d’image plus précise par la suite.
7. Avant toute stimulation, maintenez la solution d’enregistrement en circulation pendant 5 à 10 minutes pour obtenir une base stable de fluorescence des capteurs. Modifiez la durée si nécessaire pour obtenir cette référence.
8. Remplacer la solution fluide par la solution de stimulation pendant 5 minutes pour stimuler les VNC/FB (avec du glucose, du pyruvate ou du lactate à la concentration décrite pour chaque expérience dissoute dans une solution saline ; voir chaque figure).
   REMARQUE : La durée de la stimulation peut varier en fonction des besoins de l’expérience (par exemple, les impulsions de glucose peuvent être augmentées à 10 min pour atteindre un plateau dans les neurones, comme indiqué précédemment¹⁶).
9. Pour maintenir l’osmolarité dans la solution de stimulation, rectifier la concentration de saccharose (un glucide non métabolisable par le cerveau de la drosophile ) en fonction de la concentration du monocarboxylate ou du glucose ajouté.
10. Changez les solutions à l’aide d’un simple système de vannes. Veillez à ne pas déplacer la platine du microscope.
11. Exposer le VNC à 80 μM de picrotoxine (PTX, flux continu) pour stimuler l’activité neuronale. Cette procédure augmente la fréquence des oscillations de Ca²⁺ , ce qui permet d’observer des changements dans les molécules métaboliquement pertinentes (par exemple, l’ATP intracellulaire).
12. À la fin de toute expérience, laver soigneusement l’ensemble du système d’écoulement, y compris les tubes et la chambre d’enregistrement, pendant au moins 10 minutes avec la solution saline et encore 10 minutes avec de l’eau distillée pour éliminer toute trace des solutions utilisées.

5. Traitement d’images et analyse de données

1. Pour traiter les images obtenues, suivez les étapes indiquées à la figure 3.
2. Importez l’image (Laconic) dans le logiciel ImageJ. L’image présente deux vues de l’échantillon : celle de gauche est le signal mTFP et celle de droite est le signal de Vénus. Sélectionnez une région qui comprend les cellules à analyser et séparez ces images (mTFP et Vénus) dans une nouvelle fenêtre. Assurez-vous que ces images contiennent exactement la même zone.
3. Ouvrez le plugin d’enregistrement et corrigez la petite dérive du tissu qui est normalement observée dans l’expérience avec la fonction corps rigide. Effectuez cette opération dans les deux images (mTFP et Vénus).
4. Sélectionnez au moins 10 régions d’intérêt (ROI) dans le cytosol des 10 cellules correspondantes dans le signal mTFP (488 nm) et transférez les sélections sur l’image de Vénus (540 nm).
5. Sélectionnez deux ou trois zones d’intérêt proches des cellules analysées mais sans signal discernable (toujours dans le VNC ou le tissu analysé, voir Figure 3). Voici les retours sur investissement de fond.
6. Avec les ROI sélectionnés dans les deux images, obtenez la valeur de gris moyenne de chaque signal à l’aide de la mesure de fonction. Transférez les données dans une feuille de données et soustrayez la valeur de fond moyenne pour chaque signal.
7. Déterminez le rapport de fluorescence mTFP sur Vénus (pour Laconic et Pyronique). Cette valeur est calculée différemment des autres capteurs FRET décrits ici (où le rapport est généralement YFP/CFP) car lorsqu’ils sont liés à leurs substrats respectifs, le Laconic et le Pyronic réduisent leur efficacité FRET.
8. Normalisez les données en divisant chaque valeur enregistrée par la ligne de base. Dans une fiche technique séparée, calculez la base de référence en prenant la valeur moyenne du rapport mTFP/Vénus pendant les 2 minutes précédant le stimulus.
9. Pour les mesures de glucose et d’ATP à l’aide de capteurs FRET, calculez le rapport YFP/CFP et normalisez les données comme décrit à l’étape 5.8.

Résultats

Jusqu’à 1 h, cette procédure permet de mesurer facilement les changements intracellulaires dans la fluorescence des capteurs de monocarboxylate et de glucose. Comme le montre la figure 4, les capteurs laconiques dans les cellules gliales et les motoneurones répondent à 1 mM de lactate à un rythme similaire au début de l’impulsion, mais les motoneurones atteignent une augmentation plus élevée par rapport à la ligne de base pendant l’impulsion de 5 minutes, comme démontré pré...

Discussion

L’utilisation du modèle de la drosophile pour l’étude du métabolisme cérébral est relativement nouvelle²⁶, et il a été démontré qu’il partage plus de caractéristiques que prévu avec le métabolisme des mammifères, qui a été principalement étudié in vitro dans des cultures de neurones primaires ou des tranches de cerveau. La drosophile excelle dans les expériences in vivo grâce à la batterie d’outils génétiques et de capteurs généti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-