Visualisation des monocarboxylates et d’autres métabolites pertinents dans le cerveau larvaire de la drosophile ex vivo à l’aide de capteurs génétiquement codés

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour visualiser le transport des monocarboxylates, du glucose et de l’ATP dans les cellules gliales et les neurones à l’aide de capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés dans une préparation cérébrale ex-vivo de larves de drosophile .

Résumé

Les besoins énergétiques élevés du cerveau dus à l’activité électrique sont l’une de leurs caractéristiques les plus distinctives. Ces besoins sont satisfaits par la production d’ATP à partir du glucose et de ses métabolites, tels que les monocarboxylates lactate et pyruvate. On ne sait toujours pas comment ce processus est réglementé ni qui en sont les principaux acteurs, en particulier chez la drosophile.

En utilisant des capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés, nous présentons une méthode simple pour mesurer le transport des monocarboxylates et du glucose dans les cellules gliales et les neurones dans une préparation ex-vivo du cerveau larvaire de la drosophile . Le protocole décrit comment disséquer et coller un cerveau larvaire exprimant l’un des capteurs à une lamelle en verre.

Nous présentons les résultats d’une expérience complète dans laquelle le transport du lactate a été mesuré dans le cerveau des larves en neutralisant des transporteurs de monocarboxylate précédemment identifiés dans les cellules gliales. De plus, nous démontrons comment augmenter rapidement l’activité neuronale et suivre les changements de métabolites dans le cerveau actif. La méthode décrite, qui fournit toutes les informations nécessaires, peut être utilisée pour analyser d’autres tissus vivants de la drosophile .

Introduction

Le cerveau a des besoins énergétiques élevés en raison du coût élevé de la restauration des gradients ioniques dans les neurones causés par la génération et la transmission du signal électrique neuronal, ainsi que par la transmission synaptique ^1,2. On a longtemps pensé que cette forte demande énergétique était satisfaite par l’oxydation continue du glucose pour produire de l’ATP³. Des transporteurs spécifiques à la barrière hémato-encéphalique transfèrent le glucose dans le sang vers le cerveau. Des niveaux glycémiques constants garantissent que le cerveau reçoit un apport constant de ....

Protocole

1. Entretien de la souche de mouche et synchronisation larvaire

1. Pour réaliser ces expériences, utilisez des cultures de mouches élevées à 25 °C sur des aliments standard pour drosophiles composés de 10 % de levure, 8 % de glucose, 5 % de farine de blé, 1,1 % de gélose, 0,6 % d’acide propionique et 1,5 % de méthylparabène.
2. Pour suivre ce protocole, utilisez les lignes suivantes : w¹¹¹⁸ (fond de contrôle expérimental), OK6-GAL4 (pilote pour les motoneurones), repo-GAL4 (pilote pour toutes les cellules gliales), CG-GAL4 (pilote pour les corps adipeux), UAS-Pyronic (capteur de pyruvate), UAS-FLII¹²

Discussion

L’utilisation du modèle de la drosophile pour l’étude du métabolisme cérébral est relativement nouvelle²⁶, et il a été démontré qu’il partage plus de caractéristiques que prévu avec le métabolisme des mammifères, qui a été principalement étudié in vitro dans des cultures de neurones primaires ou des tranches de cerveau. La drosophile excelle dans les expériences in vivo grâce à la batterie d’outils génétiques et de capteurs généti.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-