Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar o transporte de monocarboxilatos, glicose e ATP em células gliais e neurônios usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila .

Resumo

As altas necessidades energéticas dos cérebros devido à atividade elétrica são uma de suas características mais distintivas. Esses requisitos são atendidos pela produção de ATP a partir da glicose e seus metabólitos, como os monocarboxilatos lactato e piruvato. Ainda não está claro como esse processo é regulamentado ou quem são os principais atores, particularmente em Drosophila.

Usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente, apresentamos um método simples para medir o transporte de monocarboxilatos e glicose em células gliais e neurônios em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila . O protocolo descreve como dissecar e aderir um cérebro larval expressando um dos sensores a uma lamínula de vidro.

Apresentamos os resultados de um experimento inteiro em que o transporte de lactato foi medido em cérebros de larvas derrubando transportadores monocarboxilatos previamente identificados em células gliais. Além disso, demonstramos como aumentar rapidamente a atividade neuronal e rastrear alterações de metabólitos no cérebro ativo. O método descrito, que fornece todas as informações necessárias, pode ser usado para analisar outros tecidos vivos de Drosophila .

Introdução

O cérebro apresenta elevadas necessidades energéticas devido ao alto custo de restauração de gradientes iônicos em neurônios causados pela geração e transmissão de sinais elétricos neuronais, bem como pela transmissão sináptica ^1,2. Há muito se pensa que essa alta demanda energética é atendida pela oxidação contínua da glicose para produzir ATP³. Transportadores específicos na barreira hematoencefálica transferem a glicose no sangue para o cérebro. Níveis glicêmicos constantes garantem que o cérebro receba um suprimento constante de glicose⁴. Curiosamente, cresce....

Protocolo

1. Manutenção de cepas volantes e sincronização larval

1. Para a realização desses experimentos, utilizaram-se culturas de moscas criadas a 25 °C em alimento padrão de Drosophila composto por 10% de levedura, 8% de glicose, 5% de farinha de trigo, 1,1% de ágar, 0,6% de ácido propiônico e 1,5% de metilparabeno.
2. Para seguir este protocolo, use as seguintes linhas: w¹¹¹⁸ (fundo de controle experimental), OK6-GAL4 (driver para neurônios motores), repo-GAL4 (driver para todas as células gliais), CG-GAL4 (driver para corpos gordos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (sensor de gli....

Discussão

O uso do modelo de Drosophila para o estudo do metabolismo cerebral é relativamente novo²⁶, e tem sido demonstrado que ele compartilha mais características com o metabolismo de mamíferos do que o esperado, o que tem sido estudado principalmente in vitro em culturas de neurônios primários ou fatias cerebrais. Drosophila se destaca em experimentos in vivo graças à bateria de ferramentas genéticas e sensores codificados geneticamente disponíveis que permit.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-