Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar o transporte de monocarboxilatos, glicose e ATP em células gliais e neurônios usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila .

Resumo

As altas necessidades energéticas dos cérebros devido à atividade elétrica são uma de suas características mais distintivas. Esses requisitos são atendidos pela produção de ATP a partir da glicose e seus metabólitos, como os monocarboxilatos lactato e piruvato. Ainda não está claro como esse processo é regulamentado ou quem são os principais atores, particularmente em Drosophila.

Usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente, apresentamos um método simples para medir o transporte de monocarboxilatos e glicose em células gliais e neurônios em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila . O protocolo descreve como dissecar e aderir um cérebro larval expressando um dos sensores a uma lamínula de vidro.

Apresentamos os resultados de um experimento inteiro em que o transporte de lactato foi medido em cérebros de larvas derrubando transportadores monocarboxilatos previamente identificados em células gliais. Além disso, demonstramos como aumentar rapidamente a atividade neuronal e rastrear alterações de metabólitos no cérebro ativo. O método descrito, que fornece todas as informações necessárias, pode ser usado para analisar outros tecidos vivos de Drosophila .

Introdução

O cérebro apresenta elevadas necessidades energéticas devido ao alto custo de restauração de gradientes iônicos em neurônios causados pela geração e transmissão de sinais elétricos neuronais, bem como pela transmissão sináptica ^1,2. Há muito se pensa que essa alta demanda energética é atendida pela oxidação contínua da glicose para produzir ATP³. Transportadores específicos na barreira hematoencefálica transferem a glicose no sangue para o cérebro. Níveis glicêmicos constantes garantem que o cérebro receba um suprimento constante de glicose⁴. Curiosamente, crescentes evidências experimentais sugerem que moléculas derivadas do metabolismo da glicose, como o lactato e o piruvato, desempenham um papel importante na produção de energia das células cerebrais ^5,6. No entanto, ainda há algum debate sobre a importância dessas moléculas para a produção de energia e quais células do cérebro as produzem ou utilizam ^7,8. A falta de ferramentas moleculares apropriadas com a alta resolução temporal e espacial necessárias para esta tarefa é uma questão significativa que tem impedido que esta controvérsia seja completamente resolvida.

O desenvolvimento e a aplicação de vários sensores metabólicos fluorescentes projetados resultaram em um aumento notável em nossa compreensão de onde e como os metabólitos são produzidos e usados, bem como como os fluxos metabólicos ocorrem durante a atividade neuronal basal e alta⁹. Sensores metabólicos codificados geneticamente, baseados na microscopia de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), como ATeam (ATP), FLII¹²Pglu700μδ6 (glicose), lacônico (lactato) e pirônico (piruvato), têm contribuído para o entendimento do metabolismo energético cerebral 10,11,12,13. No entanto, devido aos altos custos e equipamentos sofisticados necessários para a realização de experimentos em animais vivos ou tecidos, os resultados em modelos de vertebrados ainda são primariamente limitados a culturas de células (células gliais e neurônios).

O uso emergente do modelo de Drosophila para expressar esses sensores revelou que as principais características metabólicas são conservadas em todas as espécies e sua função pode ser facilmente abordada com esta ferramenta. Mais importante, o modelo de Drosophila lançou luz sobre como a glicose e o lactato/piruvato são transportados e metabolizados no cérebro das moscas, a ligação entre o consumo de monocarboxilato e a formação da memória, e a notável demonstração de como aumentos na atividade neural e fluxo metabólico se sobrepõem 14,15,16,17. O método apresentado aqui para medir os níveis de monocarboxilato, glicose e ATP usando sensores FRET codificados geneticamente expressos no cérebro da larva permite que os pesquisadores aprendam mais sobre como o cérebro de Drosophila usa energia, que pode ser aplicada aos cérebros de outros animais.

Mostramos que este método é eficaz na detecção de lactato e glicose em células gliais e neurônios, e que um transportador monocarboxilato (Chaski) está envolvido na importação de lactato para as células gliais. Também demonstramos um método simples para estudar as alterações dos metabólitos durante o aumento da atividade neuronal, que pode ser facilmente induzido pela aplicação em banho de um antagonista do receptor_{GABA A} . Finalmente, mostramos que esta metodologia pode ser usada para medir o transporte de monocarboxilato e glicose em outros tecidos metabolicamente significativos, como corpos adiposos.

Protocolo

1. Manutenção de cepas volantes e sincronização larval

1. Para a realização desses experimentos, utilizaram-se culturas de moscas criadas a 25 °C em alimento padrão de Drosophila composto por 10% de levedura, 8% de glicose, 5% de farinha de trigo, 1,1% de ágar, 0,6% de ácido propiônico e 1,5% de metilparabeno.
2. Para seguir este protocolo, use as seguintes linhas: w¹¹¹⁸ (fundo de controle experimental), OK6-GAL4 (driver para neurônios motores), repo-GAL4 (driver para todas as células gliais), CG-GAL4 (driver para corpos gordos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (sensor de glicose), UAS-Laconic (sensor de lactato), UAS-GCaMP6f (sensor de cálcio), UAS-AT1.03NL (sensor ATP) e UAS-Chk RNAi GD1829. Todas as linhagens que expressam sensores ou RNAi estão no background genético w¹¹¹⁸ .
3. Para obter larvas errantes sincronizadas de terceiro ínstar, colocar 300 moscas (3-5 dias de idade, 100 machos, 200 fêmeas virgens) do cruzamento genético desejado na câmara de oviposição, que contém uma placa de Petri de 60 mm coberta com agarose a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque uma gota de levedura líquida/cremosa (1,5 cm de diâmetro) no centro da placa para incentivar as moscas a botar ovos (Figura 1).
4. Manter as moscas a 25 °C durante 3 dias, substituindo a placa de Petri de agarose por uma fresca e levedura recém-dissolvida duas vezes por dia.
5. Deixe as moscas botarem ovos por 4 h no quarto dia antes de trocar a placa de Petri. Remova esta placa. Em seguida, por 3 h, deixe as moscas depositarem ovos em uma nova placa de agarose com levedura recém-dissolvida. Use essas larvas nos experimentos.
6. Após 3 h, retire a placa que contém os ovos e coloque-a em uma incubadora de 25 °C por 24 h.
7. Recolher 50 a 100 larvas recém-eclodidas desta placa (0 h após a eclosão das larvas) e colocá-las num frasco de plástico contendo alimento padrão. Para permitir que as larvas se alimentem corretamente, certifique-se de que o alimento esteja moído e macio. Use as larvas 96 h após a transferência.

2. Faça as tampas de vidro com poli-L-lisina

1. Realizar esta etapa 1 h antes da dissecção larval. Em uma placa de cultura celular de 6 poços, coloque lamínulas de vidro de 25 mm (o diâmetro das tampas a serem usadas depende da câmara de registro disponível no microscópio).
2. Coloque uma gota (300 μL) de poli-L-lisina no centro de cada lamínula durante 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Lavar cada lamínula 3x com água destilada e, em seguida, 2x com uma solução salina desprovida de Ca²⁺ (a mesma solução utilizada para dissecar as larvas, ver passo 3.2). Instale as tampas na câmara de gravação e preencha-a com solução salina livre de Ca²⁺.
   NOTA: Embora o cérebro da larva possa aderir diretamente às lamínulas de vidro, a adesão é fraca, e o cérebro ocasionalmente se move ou desloca durante o experimento devido ao fluxo contínuo de solução salina. A adição da etapa de poli-L-lisina reduz o risco de movimentos ou mesmo perda cerebral como resultado das lavagens.

3. Dissecção do cordão nervoso ventral (VNC) e corpos gordurosos (corpos estranhos)

1. Reúna as larvas errantes de terceiro ínstar do cruzamento genético desejado (a partir do passo 1.7) e lave-as completamente 3x com água destilada.
2. Colocar as larvas em uma placa de dissecção de vidro contendo 750 μL de solução salina gelada nominalmente zero de Ca²⁺ composta por NaCl 128 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ mM, trealose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 35 mM (pH = 6,7, medido com um medidor de pH e ajustado com NaOH 1 M e HCl 37% v/v).
   NOTA: Ajustar o pH para 6,7 é crítico porque, como observado anteriormente, o transporte de monocarboxilato é altamente dependente do pH da solução. Além disso, 6,7 corresponde ao pH na hemolinfa de uma larva de terceiro ínstar^17,18.
3. Coloque a larva sob um estereomicroscópio e faça um corte transversal na parte de trás do abdômen com um par de pinças.
4. Empurre a mandíbula com a pinça enquanto vira as larvas do avesso.
5. Observe o cordão nervoso ventral (VNC) próximo à mandíbula. Remova cuidadosamente os discos imaginários e os tecidos cérebro-caudais remanescentes.
6. Separe o VNC com o cérebro central e lobos ópticos do resto do tecido, cortando os nervos. Transferir a CNV, pegando-a com pinça dos nervos restantes e colocando-a na câmara de gravação contendo a solução de registro livre de Ca²⁺ (mesma solução do passo 3.2). Os VNCs aderirão imediatamente às tampas.
7. Para evitar a interferência dos nervos remanescentes, fixe-os na parte inferior da lamínula usando pinça (os nervos também serão fluorescentes dependendo da linha de driver utilizada) (Figura 2).
8. Para realizar experimentos em corpos gordurosos (corpos estranhos) medindo o transporte de glicose ou monocarboxilato em outro conjunto de experimentos, proceder ao isolamento dos tecidos seguindo as etapas 3.1-3.4. Uma vez que as larvas estão viradas do avesso, observe que o corpo estranho é um tecido branco, bilateral e plano.
9. Colocar os corpos estranhos isolados que expressam os sensores FRET (obtidos a partir de um cruzamento genético utilizando os condutores apropriados) na câmara de registo que contém a solução de registo sem Ca²⁺.
   OBS: O CORPO ESTRANHO é altamente hidrofóbico (tende a flutuar na superfície da solução) e extremamente vulnerável à manipulação com pinças, devendo ser manuseado com cuidado. Qualquer manuseio áspero desse tecido resultará em células mortas mais tarde (com uma diminuição da fluorescência dos sensores).
10. Coloque a câmara de registro contendo VNCs/FBs no palco do microscópio.

4. Imagem de células vivas

1. Para obter imagens dos sensores que expressam tecidos, use um microscópio de fluorescência vertical acoplado a um sistema de divisão de emissão e uma câmera CCD. Ligue o sistema de iluminação do microscópio 30 minutos antes de iniciar qualquer experimento.
   NOTA: Aqui usamos um microscópio de fluorescência Spinning Disk equipado com uma objetiva de imersão em água de 20x/0,5 para observar VNCs e FBs. A Figura 2 também mostra o uso de uma objetiva de imersão em água de 40x/0,8.
2. Para visualizar a fluorescência GCaMP6f, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão em 488 nm e 540 nm, respectivamente. Para sensores Laconic/Pyronic/ATP/glucose, defina o comprimento de onda de excitação em 440 nm e os comprimentos de onda de emissão em 488 nm (mTFP, CFP) e 540 nm (Vênus, YFP).
3. Adquira imagens de 512 x 512 pixels a cada 2 s para GCaMP6f e a cada 10-30 s para sensores Laconic/Pyronic/ATP/glicose. Determinar a exposição ótima à fonte de luz observando a qualidade da imagem obtida. Para seguir este protocolo, certifique-se de que as imagens sejam de exposição de 300 ms para os sensores Laconic e Pyronic e de 100-150 ms para os sensores de glicose e ATP .
   NOTA: A exposição pode variar dependendo do uso de um microscópio de fluorescência confocal ou normal.
4. Uma vez instalada a câmara de registro no estágio do microscópio, coloque cuidadosamente a objetiva de imersão em água e certifique-se de que a objetiva permaneça submersa durante todo o experimento. Manter a temperatura ambiente a 25 °C.
5. Conectar a câmara de registro a um sistema de perfusão e manter os tecidos banhados na solução de registro contendo NaCl 128 mM, KCl 2 mM, CaCl₂ 1,5 mM, MgCl₂ 4 mM, trealose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 35 mM, pH 6,7 (medido com um medidor de pH e ajustado com NaOH e HCl).
6. Manter um fluxo constante de 3 mL/min de solução de registro através do tecido usando gravidade, acoplado a uma bomba peristáltica de baixo fluxo para extrair o líquido da câmara, mantendo o volume constante. Para atingir o fluxo necessário, posicione os tubos contendo solução (tubos plásticos de 50 mL) 25 cm acima do estágio do microscópio.
   NOTA: Este fluxo impulsionado pela gravidade é usado para evitar o movimento do tecido causado por bombas peristálticas, permitindo uma análise de imagem mais precisa mais tarde.
7. Antes de qualquer estimulação, mantenha a solução de gravação fluindo por 5-10 min para obter uma linha de base estável de fluorescência dos sensores. Altere a duração conforme necessário para obter essa linha de base.
8. Substitua a solução fluida pela solução de estimulação durante 5 minutos para estimular os VNC/FB (com glicose, piruvato ou lactato na concentração descrita para cada experimento dissolvido em solução salina; ver cada figura).
   NOTA: A duração da estimulação pode ser variada de acordo com as necessidades do experimento (por exemplo, pulsos de glicose podem ser aumentados para 10 min para atingir um platô nos neurônios, como relatado anteriormente¹⁶).
9. Para manter a osmolaridade na solução de estimulação, retifique a concentração de sacarose (um carboidrato não metabolizável pelo cérebro de Drosophila ) de acordo com a concentração do monocarboxilato ou glicose adicionada.
10. Troque as soluções usando um sistema simples de válvulas. Tenha cuidado para não mover o estágio do microscópio.
11. Expor o VNC a 80 μM de picrotoxina (PTX, fluxo contínuo) para estimular a atividade neuronal. Esse procedimento aumenta a frequência de oscilações de Ca²⁺ , tornando possível observar mudanças em moléculas metabolicamente relevantes (por exemplo, ATP intracelular).
12. No final de qualquer experimento, lavar cuidadosamente todo o sistema de fluxo, incluindo os tubos e a câmara de registro, por pelo menos 10 min com a solução salina e outros 10 min com água destilada para eliminar qualquer vestígio das soluções utilizadas.

5. Processamento de imagens e análise de dados

1. Para processar as imagens obtidas, prossiga com os passos mostrados na Figura 3.
2. Importe a imagem (Laconic) para o software ImageJ. A imagem tem duas visões da amostra: a esquerda é o sinal mTFP e a da direita é o sinal de Vênus. Selecione uma região que inclua as células a serem analisadas e separe essas imagens (mTFP e Vênus) em uma nova janela. Certifique-se de que essas imagens contenham exatamente a mesma área.
3. Abra o plugin de registro e corrija a pequena deriva do tecido que normalmente é observada no experimento com a função corpo rígido. Execute isso em ambas as imagens (mTFP e Vênus).
4. Selecione pelo menos 10 regiões de interesse (ROIs) no citosol das 10 células correspondentes no sinal mTFP (488 nm) e transfira as seleções para a imagem de Vênus (540 nm).
5. Selecione duas ou três ROIs próximas às células analisadas, mas sem sinal discernível (sempre dentro da VNC ou do tecido analisado, ver Figura 3). Estes são os ROIs de fundo.
6. Com as ROIs selecionadas em ambas as imagens, obtenha-se o valor médio de cinza de cada sinal usando a medida da função. Transfira os dados para uma folha de dados e subtraia o valor médio de fundo para cada sinal.
7. Determine a razão de fluorescência mTFP sobre Vênus (para Lacônico e Pirônico). Este valor é calculado de forma diferente dos outros sensores FRET descritos aqui (onde a razão é geralmente YFP/CFP) porque quando ligados aos seus respectivos substratos, tanto o Laconic quanto o Pyronic reduzem suas eficiências de FET.
8. Normalize os dados dividindo cada valor registrado pela linha de base. Em uma folha de dados separada, calcule a linha de base tomando o valor médio da razão mTFP/Vênus durante os 2 min que antecedem o estímulo.
9. Para as medições de glicose e ATP usando sensores baseados em FRET, calcule a razão YFP/CFP e normalize os dados conforme descrito na etapa 5.8.

Resultados

Por até 1 h, esse procedimento permite a fácil medição de alterações intracelulares na fluorescência de sensores de monocarboxilato e glicose. Como mostrado na Figura 4, sensores lacônicos tanto nas células gliais quanto nos neurônios motores respondem a 1 mM de lactato em uma taxa semelhante no início do pulso, mas os neurônios motores atingem um aumento maior em relação à linha de base durante o pulso de 5 min, como demonstrado anteriormente¹⁷. Essa c...

Discussão

O uso do modelo de Drosophila para o estudo do metabolismo cerebral é relativamente novo²⁶, e tem sido demonstrado que ele compartilha mais características com o metabolismo de mamíferos do que o esperado, o que tem sido estudado principalmente in vitro em culturas de neurônios primários ou fatias cerebrais. Drosophila se destaca em experimentos in vivo graças à bateria de ferramentas genéticas e sensores codificados geneticamente disponíveis que permit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-