Ex vivo Drosophila larva beynindeki monokarboksilatların ve diğer ilgili metabolitlerin genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görselleştirilmesi

Özet

Burada, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörler kullanarak glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların, glikozun ve ATP'nin taşınmasını görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Elektriksel aktiviteye bağlı olarak beyinlerin yüksek enerji gereksinimleri en ayırt edici özelliklerinden biridir. Bu gereksinimler, glikozdan ve monokarboksilatlar laktat ve piruvat gibi metabolitlerinden ATP üretimi ile karşılanır. Bu sürecin nasıl düzenlendiği veya özellikle Drosophila'daki kilit oyuncuların kim olduğu hala belirsiz.

Genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörleri kullanarak, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların ve glikozun taşınmasını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Protokol, sensörlerden birini bir cam lamele ifade eden bir larva beyninin nasıl kesileceğini ve yapıştırılacağını açıklar.

Glial hücrelerde daha önce tanımlanmış monokarboksilat taşıyıcılarını yıkarak larva beyinlerinde laktat taşınımının ölçüldüğü bütün bir deneyin sonuçlarını sunuyoruz. Ayrıca, nöronal aktivitenin nasıl hızla artırılacağını ve aktif beyindeki metabolit değişikliklerinin nasıl izleneceğini gösteriyoruz. Gerekli tüm bilgileri sağlayan tarif edilen yöntem, diğer Drosophila canlı dokularını analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

Beyin, nöronal elektrik sinyali üretimi ve iletiminin yanı sıra sinaptik iletimin neden olduğu nöronlardaki iyon gradyanlarını geri yüklemenin yüksek maliyeti nedeniyle yüksek enerji gereksinimlerine sahiptir ^1,2. Bu yüksek enerji talebinin uzun zamandır ATP³ üretmek için glikozun sürekli oksidasyonu ile karşılandığı düşünülüyordu. Kan-beyin bariyerindeki spesifik taşıyıcılar, kandaki glikozu beyne aktarır. Sabit glisemik seviyeler, beynin sabit bir glikoz kaynağı almasını sağlar⁴. İlginç bir şekilde, artan deneysel kanıtlar, laktat ve piruvat gibi glikoz metabol....

Protokol

1. Sinek suşu bakımı ve larva senkronizasyonu

1. Bu deneyleri gerçekleştirmek için, %10 maya, %8 glikoz, %5 buğday unu, %1,1 agar, %0,6 propiyonik asit ve %1,5 metilparabenden oluşan standart Drosophila gıdalarında 25 °C'de yetiştirilen sinek kültürlerini kullanın.
2. Bu protokolü takip etmek için aşağıdaki satırları kullanın: w¹¹¹⁸ (deneysel kontrol arka planı), OK6-GAL4 (motor nöronlar için sürücü), repo-GAL4 (tüm glial hücreler için sürücü), CG-GAL4 (yağ cisimleri için sürücü), UAS-Pyronic (piruvat sensörü), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (glikoz sensörü), UAS-Laconic (laktat sensörü), UAS-GCaMP6f (kalsiy....

Tartışmalar

Beyin metabolizmasının incelenmesi için Drosophila modelinin kullanımı nispeten yenidir²⁶ ve memeli metabolizması ile beklenenden daha fazla özelliği paylaştığı gösterilmiştir, bu da öncelikle birincil nöron kültürlerinde veya beyin dilimlerinde in vitro olarak incelenmiştir. Drosophila , araştırmacıların indüklenen aktivitenin neden olduğu metabolik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerine veya hatta duyusal bir uyarana ya.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-