Visualización de monocarboxilatos y otros metabolitos relevantes en el cerebro de larvas de Drosophila ex vivo utilizando sensores codificados genéticamente

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para visualizar el transporte de monocarboxilatos, glucosa y ATP en células gliales y neuronas utilizando sensores basados en transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente en una preparación cerebral larvaria de Drosophila ex-vivo .

Resumen

Los altos requerimientos energéticos de los cerebros debido a la actividad eléctrica son una de sus características más distintivas. Estos requisitos se satisfacen mediante la producción de ATP a partir de la glucosa y sus metabolitos, como los monocarboxilatos lactato y piruvato. Todavía no está claro cómo se regula este proceso o quiénes son los actores clave, particularmente en Drosophila.

Utilizando sensores basados en la transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente, presentamos un método simple para medir el transporte de monocarboxilatos y glucosa en células gliales y neuronas en una preparación cerebral de larva de Drosophila ex vivo . El protocolo describe cómo diseccionar y adherir un cerebro larvario que expresa uno de los sensores a un cubreobjetos de vidrio.

Presentamos los resultados de un experimento completo en el que se midió el transporte de lactato en cerebros de larvas mediante la eliminación de transportadores de monocarboxilato previamente identificados en células gliales. Además, demostramos cómo aumentar rápidamente la actividad neuronal y rastrear los cambios en los metabolitos en el cerebro activo. El método descrito, que proporciona toda la información necesaria, puede utilizarse para analizar otros tejidos vivos de Drosophila .

Introducción

El cerebro tiene altos requerimientos de energía debido al alto costo de restaurar los gradientes iónicos en las neuronas causados por la generación y transmisión de señales eléctricas neuronales, así como la transmisión sináptica ^1,2. Durante mucho tiempo se ha pensado que esta alta demanda de energía se satisface mediante la oxidación continua de la glucosa para producir ATP³. Transportadores específicos en la barrera hematoencefálica transfieren la glucosa de la sangre al cerebro. Los niveles glucémicos constantes aseguran que el cerebro reciba un suministro constante^{de glucosa.} Curiosamente, la creciente evidencia experimental sugiere que las moléculas derivadas del metabolismo de la glucosa, como el lactato y el piruvato, juegan un papel importante en la producción de energía de las células cerebrales ^5,6. Sin embargo, todavía existe cierto debate sobre la importancia de estas moléculas para la producción de energía y qué células del cerebro las producen o utilizan ^7,8. La falta de herramientas moleculares apropiadas con la alta resolución temporal y espacial requerida para esta tarea es un problema importante que ha impedido que esta controversia se resuelva por completo.

El desarrollo y la aplicación de varios sensores metabólicos fluorescentes diseñados han dado lugar a un aumento notable en nuestra comprensión de dónde y cómo se producen y utilizan los metabolitos, así como de cómo se producen los flujos metabólicos durante la actividad basal y neuronal^alta. Los sensores metabólicos codificados genéticamente basados en la microscopía de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster, como ATeam (ATP), FLII¹²Pglu700μδ6 (glucosa), Laconic (lactato) y Pyronic (piruvato), han contribuido a nuestra comprensión del metabolismo energético cerebral 10,11,12,13. Sin embargo, debido a los altos costos y al equipo sofisticado requerido para realizar experimentos en animales o tejidos vivos, los resultados en modelos de vertebrados todavía se limitan principalmente a cultivos celulares (células gliales y neuronas).

El uso emergente del modelo de Drosophila para expresar estos sensores ha revelado que las características metabólicas clave se conservan en todas las especies y su función se puede abordar fácilmente con esta herramienta. Más importante aún, el modelo de Drosophila ha arrojado luz sobre cómo la glucosa y el lactato/piruvato se transportan y metabolizan en el cerebro de la mosca, el vínculo entre el consumo de monocarboxilato y la formación de la memoria, y la notable demostración de cómo los aumentos en la actividad neuronal y el flujo metabólico se superponen 14,15,16,17. El método presentado aquí para medir los niveles de monocarboxilato, glucosa y ATP utilizando sensores FRET codificados genéticamente expresados en el cerebro de las larvas permite a los investigadores aprender más sobre cómo el cerebro de Drosophila utiliza la energía, que se puede aplicar a los cerebros de otros animales.

Demostramos que este método es eficaz para detectar lactato y glucosa en células gliales y neuronas, y que un transportador de monocarboxilato (Chaski) está implicado en la importación de lactato a las células gliales. También demostramos un método simple para estudiar los cambios en los metabolitos durante el aumento de la actividad neuronal, que se puede inducir fácilmente mediante la aplicación en baño de un antagonista del receptor GABA_A . Finalmente, demostramos que esta metodología se puede utilizar para medir el transporte de monocarboxilato y glucosa en otros tejidos metabólicamente significativos, como los cuerpos grasos.

Protocolo

1. Mantenimiento de la cepa de mosca y sincronización larvaria

1. Para realizar estos experimentos, se utilizaron cultivos de moscas criados a 25 °C en alimentos estándar de Drosophila compuestos por un 10% de levadura, un 8% de glucosa, un 5% de harina de trigo, un 1,1% de agar, un 0,6% de ácido propiónico y un 1,5% de metilparabeno.
2. Para seguir este protocolo, utilice las siguientes líneas: w¹¹¹⁸ (antecedentes de control experimental), OK6-GAL4 (controlador para neuronas motoras), repo-GAL4 (controlador para todas las células gliales), CG-GAL4 (controlador para cuerpos grasos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (sensor de glucosa), UAS-Laconic (sensor de lactato), UAS-GCaMP6f (sensor de calcio), UAS-AT1.03NL (sensor de ATP) y UAS-Chk RNAi GD1829. Todas las líneas que expresan sensores o RNAi están en el fondo genético w¹¹¹⁸ .
3. Para obtener larvas errantes sincronizadas del tercer estadio, coloque 300 moscas (de 3 a 5 días de edad, 100 machos, 200 hembras vírgenes) del cruce genético deseado en la cámara de puesta de huevos, que contiene una placa de Petri de 60 mm cubierta con agarosa al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Coloque una gota de levadura líquida/cremosa (1,5 cm de diámetro) en el centro de la placa para animar a las moscas a poner huevos (Figura 1).
4. Mantenga las moscas a 25 °C durante 3 días, reemplazando la placa de Petri de agarosa por una fresca y levadura recién disuelta dos veces al día.
5. Deje que las moscas pongan huevos durante 4 h el cuarto día antes de cambiar la placa de Petri. Retira esta placa. Luego, durante 3 h, deje que las moscas pongan huevos en una nueva placa de agarosa con levadura recién disuelta. Utiliza estas larvas en los experimentos.
6. Después de 3 h, retire la placa que contiene los huevos y colóquela en una incubadora a 25 °C durante 24 h.
7. Recoja de 50 a 100 larvas recién eclosionadas de esta placa (0 h después de la eclosión de las larvas) y colóquelas en un frasco de plástico que contenga alimento estándar. Para permitir que las larvas se alimenten adecuadamente, asegúrese de que la comida esté molida y blanda. Utilizar las larvas 96 h después de la transferencia.

2. Hacer los cubreobjetos de vidrio con poli-L-lisina

1. Realice este paso 1 h antes de la disección larvaria. En una placa de cultivo celular de 6 pocillos, coloque cubreobjetos de vidrio de 25 mm (el diámetro de las cubiertas a utilizar depende de la cámara de registro disponible en el microscopio).
2. Coloque una gota (300 μL) de poli-L-lisina en el centro de cada cubreobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Lave cada cubreobjetos 3 veces con agua destilada, luego 2 veces con una solución salina desprovista de Ca²⁺ (la misma solución utilizada para diseccionar las larvas, consulte el paso 3.2). Instale las tapas en la cámara de grabación y llénela con solución salina libre de Ca²⁺.
   NOTA: Aunque el cerebro de la larva puede adherirse directamente a los cubreobjetos de vidrio, la adherencia es débil y el cerebro ocasionalmente se mueve o desplaza durante el experimento debido al flujo continuo de solución salina. La adición del paso de poli-L-lisina reduce el riesgo de movimientos o incluso pérdida de cerebro como resultado de los lavados.

3. Diseccionar el cordón nervioso ventral (VNC) y los cuerpos grasos (FB)

1. Reúna las larvas errantes del tercer estadio del cruce genético deseado (del paso 1.7) y lávelas bien 3 veces con agua destilada.
2. Colocar las larvas en un recipiente de disección de vidrio que contenga 750 μL de solución salina helada de Ca²⁺ nominalmente nula compuesta por 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl₂, 5 mM de trehalosa, 5 mM de HEPES y 35 mM de sacarosa (pH = 6,7, medido con un medidor de pH y ajustado con 1 M de NaOH y HCl 37% v/v).
   NOTA: Establecer el pH en 6.7 es fundamental porque, como se observó anteriormente, el transporte de monocarboxilato depende en gran medida del pH de la solución. Además, 6,7 corresponde al pH en la hemolinfa de una larva de tercer estadio^17,18.
3. Coloque la larva bajo un microscopio estereoscópico y haga un corte transversal en la parte posterior del abdomen con un par de fórceps.
4. Empuja la mandíbula con las pinzas mientras volteas las larvas del revés.
5. Observe el cordón nervioso ventral (VNC, por sus siglas en inglés) junto a la mandíbula. Retire con cuidado los discos imaginales y los tejidos cerebrales y caudales restantes.
6. Separe el VNC con el cerebro central y los lóbulos ópticos del resto del tejido cortando los nervios. Transfiera el VNC, recojándolo con pinzas de los nervios restantes y colocándolo en la cámara de registro que contiene la solución de grabación libre de Ca²⁺ (la misma solución del paso 3.2). Los VNC se adherirán inmediatamente a los cubreobjetos.
7. Para evitar la interferencia de los nervios restantes, fíjelos en la parte inferior del cubreobjetos con pinzas (los nervios también serán fluorescentes dependiendo de la línea de conducción utilizada) (Figura 2).
8. Para realizar experimentos en cuerpos grasos (FBs) midiendo el transporte de glucosa o monocarboxilato en otro conjunto de experimentos, proceda a aislar los tejidos siguiendo los pasos 3.1-3.4. Una vez que las larvas se hayan volteado, observe que el FB es un tejido blanco, bilateral y plano.
9. Coloque los FB aislados que expresan los sensores FRET (obtenidos a partir de un cruce genético utilizando los controladores apropiados) en la cámara de registro que contiene la solución de registro sin Ca²⁺.
   NOTA: El FB es altamente hidrofóbico (tiende a flotar en la superficie de la solución) y extremadamente vulnerable a la manipulación con fórceps, debe manipularse con cuidado. Cualquier manipulación brusca de este tejido dará lugar a células muertas más adelante (con una disminución de la fluorescencia de los sensores).
10. Coloque la cámara de registro que contiene VNC/FB en la platina del microscopio.

4. Obtención de imágenes de células vivas

1. Para adquirir imágenes de los sensores de expresión de tejido, utilice un microscopio de fluorescencia vertical acoplado a un sistema de división de emisiones y una cámara CCD. Encienda el sistema de iluminación del microscopio 30 minutos antes de comenzar cualquier experimento.
   NOTA: Aquí utilizamos un microscopio de fluorescencia de disco giratorio equipado con un objetivo de inmersión en agua de 20x/0,5 para observar tanto VNC como FB. La Figura 2 también muestra el uso de un objetivo de inmersión en agua de 40x/0,8.
2. Para visualizar la fluorescencia GCaMP6f, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 488 nm y 540 nm, respectivamente. Para sensores lacónicos/piroónicos/ATP/glucosa, ajuste la longitud de onda de excitación a 440 nm y las longitudes de onda de emisión a 488 nm (mTFP, CFP) y 540 nm (Venus, YFP).
3. Adquiera imágenes de 512 x 512 píxeles cada 2 s para GCaMP6f y cada 10-30 s para sensores lacónicos/piroónicos/ATP/glucosa. Determinar la exposición óptima a la fuente de luz observando la calidad de la imagen obtenida. Para seguir este protocolo, asegúrese de que las imágenes sean de exposición de 300 ms para los sensores lacónicos y piroónicos y de 100-150 ms para los sensores de glucosa y ATP .
   NOTA: La exposición puede variar según el uso de un microscopio de fluorescencia confocal o normal.
4. Una vez instalada la cámara de registro en la platina del microscopio, coloque con cuidado el objetivo de inmersión en agua y asegúrese de que el objetivo permanezca sumergido durante todo el experimento. Mantenga la temperatura ambiente a 25 °C.
5. Conecte la cámara de registro a un sistema de perfusión y mantenga los tejidos bañados en la solución de registro que contiene 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂, 4 mM de MgCl₂, 5 mM de trehalosa, 5 mM de HEPES y 35 mM de sacarosa, pH 6,7 (medido con un medidor de pH y ajustado con NaOH y HCl).
6. Mantener un flujo constante de 3 mL/min de solución de registro a través del tejido utilizando la gravedad, acoplado a una bomba peristáltica de bajo flujo para extraer el líquido de la cámara manteniendo el volumen constante. Para lograr el caudal requerido, coloque los tubos que contienen solución (tubos de plástico de 50 ml) a 25 cm por encima de la platina del microscopio.
   NOTA: Este flujo impulsado por la gravedad se utiliza para evitar el movimiento del tejido causado por las bombas peristálticas, lo que permite un análisis de imágenes más preciso más adelante.
7. Antes de cualquier estimulación, mantenga la solución de registro fluyendo durante 5-10 minutos para obtener una línea de base estable de fluorescencia de los sensores. Cambie la duración según sea necesario para obtener esta línea base.
8. Sustituya la solución fluida por la solución de estimulación durante 5 min para estimular los VNC/FB (con glucosa, piruvato o lactato a la concentración descrita para cada experimento disuelto en solución salina; véase cada figura).
   NOTA: La duración de la estimulación puede variar según las necesidades del experimento (por ejemplo, los pulsos de glucosa pueden aumentarse a 10 min para alcanzar una meseta en las neuronas, como se informó anteriormente¹⁶).
9. Para mantener la osmolaridad en la solución de estimulación, rectifique la concentración de sacarosa (un carbohidrato no metabolizable por el cerebro de Drosophila ) de acuerdo con la concentración del monocarboxilato o glucosa agregada.
10. Cambie las soluciones mediante un sencillo sistema de válvulas. Tenga cuidado de no mover la platina del microscopio.
11. Exponer el VNC a 80 μM de picrotoxina (PTX, flujo continuo) para estimular la actividad neuronal. Este procedimiento aumenta la frecuencia de las oscilaciones de Ca²⁺ , lo que permite observar cambios en moléculas metabólicamente relevantes (por ejemplo, ATP intracelular).
12. Al final de cualquier experimento, lavar a fondo todo el sistema de flujo, incluidos los tubos y la cámara de registro, durante al menos 10 minutos con la solución salina y otros 10 minutos con agua destilada para eliminar cualquier rastro de las soluciones utilizadas.

5. Procesamiento de imágenes y análisis de datos

1. Para procesar las imágenes obtenidas, continúe con los pasos que se muestran en la Figura 3.
2. Importe la imagen (lacónica) al software ImageJ. La imagen tiene dos vistas de la muestra: la de la izquierda es la señal mTFP y la de la derecha es la señal de Venus. Seleccione una región que incluya las células que se van a analizar y separe estas imágenes (mTFP y Venus) en una nueva ventana. Asegúrese de que estas imágenes contengan exactamente la misma área.
3. Abra el complemento de registro y corrija la pequeña deriva del tejido que normalmente se observa en el experimento con la función cuerpo rígido. Realice esto en ambas imágenes (mTFP y Venus).
4. Seleccione al menos 10 regiones de interés (ROI) en el citosol de las 10 células correspondientes en la señal mTFP (488 nm) y transfiera las selecciones a la imagen de Venus (540 nm).
5. Seleccione dos o tres ROI cercanos a las células que se están analizando pero sin señal discernible (siempre dentro del VNC o tejido analizado, ver Figura 3). Estos son los ROI de fondo.
6. Con los ROI seleccionados en ambas imágenes, obtenga el valor medio de gris de cada señal utilizando la función measure. Transfiera los datos a una hoja de datos y reste el valor de fondo promedio para cada señal.
7. Determine la relación de fluorescencia mTFP sobre Venus (para lacónico y piroónico). Este valor se calcula de manera diferente a los otros sensores FRET descritos aquí (donde la relación suele ser YFP/CFP) porque cuando se unen a sus respectivos sustratos, tanto Laconic como Pyronic reducen sus eficiencias FRET.
8. Normalice los datos dividiendo cada valor registrado por la línea base. En una hoja de datos separada, calcule la línea de base tomando el valor medio de la relación mTFP/Venus durante los 2 minutos anteriores al estímulo.
9. Para las mediciones de glucosa y ATP utilizando sensores basados en FRET, calcule la relación YFP/CFP y normalice los datos como se describe en el paso 5.8.

Resultados

Durante un máximo de 1 h, este procedimiento permite medir fácilmente los cambios intracelulares en la fluorescencia de los sensores de monocarboxilato y glucosa. Como se muestra en la Figura 4, los sensores lacónicos tanto en las células gliales como en las neuronas motoras responden al lactato de 1 mM a una velocidad similar al inicio del pulso, pero las neuronas motoras alcanzan un aumento mayor sobre la línea de base durante el pulso de 5 minutos, como se demostró anteriormente

Discusión

El uso del modelo de Drosophila para el estudio del metabolismo cerebral es relativamente nuevo²⁶, y se ha demostrado que comparte más características con el metabolismo de los mamíferos de lo esperado, que se ha estudiado principalmente in vitro en cultivos de neuronas primarias o cortes de cerebro. Drosophila sobresale en experimentos in vivo gracias a la batería de herramientas genéticas y sensores codificados genéticamente disponibles que permiten a lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-