Visualización de monocarboxilatos y otros metabolitos relevantes en el cerebro de larvas de Drosophila ex vivo utilizando sensores codificados genéticamente

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para visualizar el transporte de monocarboxilatos, glucosa y ATP en células gliales y neuronas utilizando sensores basados en transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente en una preparación cerebral larvaria de Drosophila ex-vivo .

Resumen

Los altos requerimientos energéticos de los cerebros debido a la actividad eléctrica son una de sus características más distintivas. Estos requisitos se satisfacen mediante la producción de ATP a partir de la glucosa y sus metabolitos, como los monocarboxilatos lactato y piruvato. Todavía no está claro cómo se regula este proceso o quiénes son los actores clave, particularmente en Drosophila.

Utilizando sensores basados en la transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente, presentamos un método simple para medir el transporte de monocarboxilatos y glucosa en células gliales y neuronas en una preparación cerebral de larva de Drosophila ex vivo . El protocolo describe cómo diseccionar y adherir un cerebro larvario que expresa uno de los sensores a un cubreobjetos de vidrio.

Presentamos los resultados de un experimento completo en el que se midió el transporte de lactato en cerebros de larvas mediante la eliminación de transportadores de monocarboxilato previamente identificados en células gliales. Además, demostramos cómo aumentar rápidamente la actividad neuronal y rastrear los cambios en los metabolitos en el cerebro activo. El método descrito, que proporciona toda la información necesaria, puede utilizarse para analizar otros tejidos vivos de Drosophila .

Introducción

El cerebro tiene altos requerimientos de energía debido al alto costo de restaurar los gradientes iónicos en las neuronas causados por la generación y transmisión de señales eléctricas neuronales, así como la transmisión sináptica ^1,2. Durante mucho tiempo se ha pensado que esta alta demanda de energía se satisface mediante la oxidación continua de la glucosa para producir ATP³. Transportadores específicos en la barrera hematoencefálica transfieren la glucosa de la sangre al cerebro. Los niveles glucémicos constantes aseguran que el cerebro reciba un suministro constante

Protocolo

1. Mantenimiento de la cepa de mosca y sincronización larvaria

1. Para realizar estos experimentos, se utilizaron cultivos de moscas criados a 25 °C en alimentos estándar de Drosophila compuestos por un 10% de levadura, un 8% de glucosa, un 5% de harina de trigo, un 1,1% de agar, un 0,6% de ácido propiónico y un 1,5% de metilparabeno.
2. Para seguir este protocolo, utilice las siguientes líneas: w¹¹¹⁸ (antecedentes de control experimental), OK6-GAL4 (controlador para neuronas motoras), repo-GAL4 (controlador para todas las células gliales), CG-GAL4 (controlador para cuerpos grasos), UAS-Pyronic (sensor de pir....

Discusión

El uso del modelo de Drosophila para el estudio del metabolismo cerebral es relativamente nuevo²⁶, y se ha demostrado que comparte más características con el metabolismo de los mamíferos de lo esperado, que se ha estudiado principalmente in vitro en cultivos de neuronas primarias o cortes de cerebro. Drosophila sobresale en experimentos in vivo gracias a la batería de herramientas genéticas y sensores codificados genéticamente disponibles que permiten a lo.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-