Visualizzazione dei monocarbossilati e di altri metaboliti rilevanti nel cervello larvale ex vivo di Drosophila utilizzando sensori geneticamente codificati

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare il trasporto di monocarbossilati, glucosio e ATP nelle cellule gliali e nei neuroni utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster geneticamente codificati in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo .

Abstract

L'elevato fabbisogno energetico del cervello dovuto all'attività elettrica è una delle loro caratteristiche più distintive. Questi requisiti sono soddisfatti dalla produzione di ATP dal glucosio e dai suoi metaboliti, come i monocarbossilati lattato e piruvato. Non è ancora chiaro come questo processo sia regolato o chi siano gli attori chiave, in particolare in Drosophila.

Utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster codificati geneticamente, presentiamo un metodo semplice per misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo . Il protocollo descrive come sezionare e far aderire un cervello larvale che esprime uno dei sensori su un vetrino coprioggetto.

Presentiamo i risultati di un intero esperimento in cui il trasporto del lattato è stato misurato nel cervello larvale abbattendo i trasportatori di monocarbossilati precedentemente identificati nelle cellule gliali. Inoltre, dimostriamo come aumentare rapidamente l'attività neuronale e monitorare i cambiamenti dei metaboliti nel cervello attivo. Il metodo descritto, che fornisce tutte le informazioni necessarie, può essere utilizzato per analizzare altri tessuti viventi di Drosophila .

Introduzione

Il cervello ha un elevato fabbisogno energetico a causa dell'elevato costo del ripristino dei gradienti ionici nei neuroni causati dalla generazione e dalla trasmissione del segnale elettrico neuronale, nonché dalla trasmissione sinaptica ^1,2. A lungo si è pensato che questa elevata richiesta di energia fosse soddisfatta dalla continua ossidazione del glucosio per produrre ATP³. Trasportatori specifici alla barriera emato-encefalica trasferiscono il glucosio nel sangue al cervello. Livelli glicemici costanti assicurano che il cervello riceva un apporto costante di glucosio⁴. È interessante notare che una crescente evidenza sperimentale suggerisce che le molecole derivate dal metabolismo del glucosio, come il lattato e il piruvato, svolgono un ruolo importante nella produzione di energia delle cellule cerebrali ^5,6. Tuttavia, c'è ancora un certo dibattito su quanto siano importanti queste molecole per la produzione di energia e quali cellule del cervello le producano o le utilizzino ^7,8. La mancanza di strumenti molecolari appropriati con l'alta risoluzione temporale e spaziale richiesta per questo compito è un problema significativo che ha impedito che questa controversia fosse completamente risolta.

Lo sviluppo e l'applicazione di diversi sensori metabolici fluorescenti ingegnerizzati hanno portato a un notevole aumento della nostra comprensione di dove e come i metaboliti vengono prodotti e utilizzati, nonché di come i flussi metabolici si verificano durante l'attività basale e neuronale^{elevata 9}. I sensori metabolici geneticamente codificati basati sulla microscopia a trasferimento di energia a risonanza di Förster (FRET), come ATeam (ATP), FLII¹²Pglu700μδ6 (glucosio), Laconic (lattato) e Pyronic (piruvato), hanno contribuito alla nostra comprensione del metabolismo energetico cerebrale 10,11,12,13. Tuttavia, a causa dei costi elevati e delle sofisticate attrezzature necessarie per condurre esperimenti su animali vivi o tessuti, i risultati nei modelli di vertebrati sono ancora principalmente limitati alle colture cellulari (cellule gliali e neuroni).

L'uso emergente del modello Drosophila per esprimere questi sensori ha rivelato che le caratteristiche metaboliche chiave sono conservate tra le specie e la loro funzione può essere facilmente affrontata con questo strumento. Ancora più importante, il modello di Drosophila ha fatto luce su come il glucosio e il lattato/piruvato vengono trasportati e metabolizzati nel cervello del moscerino, il legame tra il consumo di monocarbossilati e la formazione della memoria e la notevole dimostrazione di come gli aumenti dell'attività neurale e del flusso metabolico si sovrappongano 14,15,16,17. Il metodo qui presentato per misurare i livelli di monocarbossilato, glucosio e ATP utilizzando sensori FRET geneticamente codificati espressi nel cervello larvale consente ai ricercatori di saperne di più su come il cervello di Drosophila utilizza l'energia, che può essere applicata al cervello di altri animali.

Mostriamo che questo metodo è efficace per rilevare il lattato e il glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni e che un trasportatore di monocarbossilati (Chaski) è coinvolto nell'importazione del lattato nelle cellule gliali. Dimostriamo anche un metodo semplice per studiare i cambiamenti dei metaboliti durante l'aumento dell'attività neuronale, che possono essere facilmente indotti dall'applicazione in bagno di un antagonista del recettore GABA_A . Infine, mostriamo che questa metodologia può essere utilizzata per misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio in altri tessuti metabolicamente significativi, come i corpi adiposi.

Protocollo

1. Mantenimento del ceppo di mosca e sincronizzazione larvale

1. Per eseguire questi esperimenti, utilizzare colture di moscerini allevate a 25 °C su un alimento standard a base di Drosophila composto dal 10% di lievito, dall'8% di glucosio, dal 5% di farina di frumento, dall'1,1% di agar, dallo 0,6% di acido propionico e dall'1,5% di metilparabene.
2. Per seguire questo protocollo, utilizzare le seguenti linee: w¹¹¹⁸ (background di controllo sperimentale), OK6-GAL4 (driver per motoneuroni), repo-GAL4 (driver per tutte le cellule gliali), CG-GAL4 (driver per corpi grassi), UAS-Pyronic (sensore di piruvato), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (sensore di glucosio), UAS-Laconic (sensore di lattato), UAS-GCaMP6f (sensore di calcio), UAS-AT1.03NL (sensore ATP) e UAS-Chk RNAi GD1829. Tutte le linee che esprimono sensori o RNAi sono nel background genetico w¹¹¹⁸ .
3. Per ottenere larve erranti sincronizzate nel terzo stadio, porre 300 mosche (3-5 giorni di età, 100 maschi, 200 femmine vergini) dell'incrocio genetico desiderato nella camera di deposizione delle uova, che contiene una capsula di Petri di 60 mm ricoperta di agarosio all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Posizionare una goccia di lievito liquido/cremoso (1,5 cm di diametro) al centro della placca per incoraggiare le mosche a deporre le uova (Figura 1).
4. Tenere le mosche a 25 °C per 3 giorni sostituendo la capsula di Petri con agarosio con una fresca e lievito appena sciolto due volte al giorno.
5. Lasciare che le mosche depongano le uova per 4 ore il quarto giorno prima di cambiare la capsula di Petri. Rimuovere questa placca. Quindi, per 3 ore, lasciare che le mosche depongano le uova in una nuova placca di agarosio con lievito appena sciolto. Usa queste larve negli esperimenti.
6. Dopo 3 ore, rimuovere la placca contenente le uova e metterla in un'incubatrice a 25 °C per 24 ore.
7. Raccogliere da 50 a 100 larve appena schiuse da questa placca (0 ore dopo la schiusa delle larve) e metterle in una fiala di plastica contenente cibo standard. Per consentire alle larve di nutrirsi correttamente, assicurarsi che il cibo sia macinato e morbido. Utilizzare le larve 96 ore dopo il trasferimento.

2. Realizzare i vetrini coprioggetti con poli-L-lisina

1. Eseguire questa fase 1 ora prima della dissezione larvale. In una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti, posizionare vetrini coprioggetti da 25 mm (il diametro dei coperchi da utilizzare dipende dalla camera di registrazione disponibile al microscopio).
2. Mettere una goccia (300 μL) di poli-L-lisina al centro di ciascun vetrino coprioggetti per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare ogni vetrino coprioggetto 3 volte con acqua distillata, poi 2 volte con una soluzione salina priva di Ca²⁺ (la stessa soluzione utilizzata per sezionare le larve, vedere il passaggio 3.2). Installare i coperchi nella camera di registrazione e riempirla con soluzione salina priva di Ca²⁺.
   NOTA: Sebbene il cervello larvale possa aderire direttamente ai vetrini coprioggetti, l'adesione è debole e il cervello occasionalmente si muove o si sposta durante l'esperimento a causa del flusso continuo di soluzione salina. L'aggiunta del gradino di poli-L-lisina riduce il rischio di movimenti o addirittura di perdita cerebrale a seguito dei lavaggi.

3. Sezionare il midollo nervoso ventrale (VNC) e i corpi adiposi (FB)

1. Raccogli le larve vaganti di terzo stadio dall'incrocio genetico desiderato (dal passaggio 1.7) e lavale accuratamente 3 volte con acqua distillata.
2. Porre le larve in un pozzetto di dissezione in vetro contenente 750 μL di soluzione salina ghiacciata nominalmente zero Ca²⁺ composta da 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 5 mM trealosio, 5 mM HEPES e 35 mM di saccarosio (pH = 6,7, misurato con un pHmetro e regolato con 1 M NaOH e HCl 37% v/v).
   NOTA: L'impostazione del pH a 6,7 è fondamentale perché, come osservato in precedenza, il trasporto dei monocarbossilati dipende fortemente dal pH della soluzione. Inoltre, 6,7 corrisponde al pH nell'emolinfa di una larva di terzo stadio^17,18.
3. Metti la larva sotto uno stereomicroscopio e fai un taglio trasversale sulla parte posteriore dell'addome con un paio di pinze.
4. Spingi la mascella con la pinza mentre capovolgi le larve.
5. Osservare il midollo nervoso ventrale (VNC) accanto alla mandibola. Rimuovere con cautela i dischi immaginali e i restanti tessuti cervello-caudali.
6. Separare il VNC con il cervello centrale e i lobi ottici dal resto del tessuto tagliando i nervi. Trasferire il VNC, prelevandolo con una pinza dai nervi rimanenti e posizionandolo nella camera di registrazione contenente la soluzione di registrazione senza Ca²⁺ (stessa soluzione del passaggio 3.2). I VNC aderiranno immediatamente ai tagliando coperchio.
7. Per evitare interferenze da parte dei nervi rimanenti, fissarli nella parte inferiore del vetrino coprioggetto utilizzando una pinza (i nervi saranno anche fluorescenti a seconda della linea di guida utilizzata) (Figura 2).
8. Per eseguire esperimenti sui corpi grassi (FB) che misurano il trasporto di glucosio o monocarbossilati in un'altra serie di esperimenti, procedere all'isolamento dei tessuti seguendo i passaggi 3.1-3.4. Una volta che le larve sono capovolte, osservare che il FB è un tessuto bianco, bilaterale, piatto.
9. Posizionare i FB isolati che esprimono i sensori FRET (ottenuti da un incrocio genetico utilizzando gli appositi driver) nella camera di registrazione contenente la soluzione di registrazione senza Ca²⁺.
   NOTA: L'FB è altamente idrofobico (tende a galleggiare sulla superficie della soluzione) ed estremamente vulnerabile alla manipolazione con pinze, deve essere maneggiato con cura. Qualsiasi manipolazione approssimativa di questo tessuto si tradurrà in cellule morte in seguito (con una diminuzione della fluorescenza dei sensori).
10. Posizionare la camera di registrazione contenente VNC/FB sul tavolino del microscopio.

4. Imaging di cellule vive

1. Per acquisire le immagini dei sensori di espressione tissutale, utilizzare un microscopio a fluorescenza verticale accoppiato a un sistema di scissione dell'emissione e a una telecamera CCD. Accendere il sistema di illuminazione del microscopio 30 minuti prima di iniziare qualsiasi esperimento.
   NOTA: Qui utilizziamo un microscopio a fluorescenza Spinning Disk dotato di un obiettivo a immersione in acqua 20x/0,5 per osservare sia VNC che FB. La Figura 2 mostra anche l'uso di un obiettivo a immersione in acqua 40x/0,8.
2. Per visualizzare la fluorescenza GCaMP6f, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente a 488 nm e 540 nm. Per i sensori laconici/pironici/ATP/glucosio, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 440 nm e le lunghezze d'onda di emissione a 488 nm (mTFP, CFP) e 540 nm (Venus, YFP).
3. Acquisisci immagini di dimensioni 512 x 512 pixel ogni 2 s per GCaMP6f e ogni 10-30 s per sensori Laconici/Pironici/ATP/glucosio. Determinare l'esposizione ottimale alla sorgente luminosa osservando la qualità dell'immagine ottenuta. Per seguire questo protocollo, assicurarsi che le immagini abbiano un'esposizione di 300 ms per i sensori laconici e pironici e di 100-150 ms per i sensori di glucosio e ATP .
   NOTA: L'esposizione può variare a seconda dell'uso di un microscopio confocale o a fluorescenza normale.
4. Una volta installata la camera di registrazione nel tavolino del microscopio, posizionare con cura l'obiettivo a immersione in acqua e assicurarsi che l'obiettivo rimanga immerso per tutta la durata dell'esperimento. Mantenere la temperatura ambiente a 25 °C.
5. Collegare la camera di registrazione a un sistema di perfusione e mantenere i tessuti immersi nella soluzione di registrazione contenente 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 5 mM trealosio, 5 mM HEPES e 35 mM saccarosio, pH 6,7 (misurato con un pHmetro e regolato con NaOH e HCl).
6. Mantenere un flusso costante di 3 ml/min di soluzione di registrazione attraverso il tessuto utilizzando la gravità, accoppiata a una pompa peristaltica a basso flusso per estrarre il liquido dalla camera mantenendo costante il volume. Per ottenere il flusso richiesto, posizionare le provette contenenti la soluzione (provette di plastica da 50 mL) 25 cm sopra il tavolino del microscopio.
   NOTA: Questo flusso guidato dalla gravità viene utilizzato per prevenire il movimento dei tessuti causato dalle pompe peristaltiche, consentendo un'analisi delle immagini più accurata in seguito.
7. Prima di qualsiasi stimolazione, mantenere la soluzione di registrazione in flusso per 5-10 minuti per ottenere una linea di base stabile di fluorescenza dai sensori. Modificare la durata in base alle esigenze per ottenere questa previsione.
8. Sostituire la soluzione fluida con la soluzione di stimolazione per 5 minuti per stimolare i VNC/FB (con glucosio, piruvato o lattato alla concentrazione descritta per ogni esperimento disciolto in soluzione salina; vedere ogni figura).
   NOTA: La durata della stimolazione può essere variata in base alle esigenze dell'esperimento (ad esempio, gli impulsi di glucosio possono essere aumentati a 10 min per raggiungere un plateau nei neuroni, come riportato in precedenza¹⁶).
9. Per mantenere l'osmolarità nella soluzione di stimolazione, rettificare la concentrazione di saccarosio (un carboidrato non metabolizzabile dal cervello della Drosophila ) in base alla concentrazione del monocarbossilato o del glucosio aggiunto.
10. Cambiare le soluzioni utilizzando un semplice sistema di valvole. Fare attenzione a non spostare il tavolino del microscopio.
11. Esporre il VNC a 80 μM di picrotossina (PTX, a flusso continuo) per stimolare l'attività neuronale. Questa procedura aumenta la frequenza delle oscillazioni di Ca²⁺ , rendendo possibile osservare cambiamenti in molecole metabolicamente rilevanti (ad esempio, ATP intracellulare).
12. Al termine di ogni esperimento, lavare accuratamente l'intero sistema di flusso, comprese le provette e la camera di registrazione, per almeno 10 minuti con la soluzione salina e altri 10 minuti con acqua distillata per eliminare ogni traccia delle soluzioni utilizzate.

5. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati

1. Per elaborare le immagini ottenute, procedere con i passaggi mostrati in Figura 3.
2. Importare l'immagine (laconica) nel software ImageJ. L'immagine ha due viste del campione: quella di sinistra è il segnale mTFP e quella a destra è il segnale di Venere. Selezionare una regione che includa le celle da analizzare e separare queste immagini (mTFP e Venere) in una nuova finestra. Assicurarsi che queste immagini contengano esattamente la stessa area.
3. Apri il plugin di registrazione e correggi la piccola deriva del tessuto che si osserva normalmente nell'esperimento con la funzione corpo rigido. Eseguire questa operazione in entrambe le immagini (mTFP e Venus).
4. Selezionare almeno 10 regioni di interesse (ROI) nel citosol delle 10 cellule corrispondenti nel segnale mTFP (488 nm) e trasferire le selezioni all'immagine di Venere (540 nm).
5. Selezionare due o tre ROI vicino alle cellule analizzate ma senza alcun segnale distinguibile (sempre all'interno del VNC o del tessuto analizzato, vedere la Figura 3). Questi sono i ROI di fondo.
6. Con i ROI selezionati in entrambe le immagini, ottenere il valore medio di grigio di ciascun segnale utilizzando la misura della funzione. Trasferisci i dati in un foglio dati e sottrai il valore medio di fondo per ogni segnale.
7. Determinare il rapporto di fluorescenza mTFP su Venere (per laconico e pironico). Questo valore viene calcolato in modo diverso rispetto agli altri sensori FRET qui descritti (dove il rapporto è solitamente YFP/CFP) perché quando sono legati ai rispettivi substrati, sia il laconico che il pironico riducono le loro efficienze FRET.
8. Normalizzare i dati dividendo ogni valore registrato per la linea di base. In una scheda tecnica separata, calcolare la linea di base prendendo il valore medio del rapporto mTFP/Venus durante i 2 minuti precedenti lo stimolo.
9. Per le misurazioni del glucosio e dell'ATP utilizzando sensori basati su FRET, calcolare il rapporto YFP/CFP e normalizzare i dati come descritto nel passaggio 5.8.

Risultati

Per un massimo di 1 ora, questa procedura consente di misurare facilmente i cambiamenti intracellulari nella fluorescenza dei sensori di monocarbossilato e glucosio. Come mostrato nella Figura 4, i sensori laconici sia nelle cellule gliali che nei motoneuroni rispondono a 1 mM di lattato a una velocità simile all'inizio dell'impulso, ma i motoneuroni raggiungono un aumento maggiore rispetto al basale durante l'impulso di 5 minuti, come precedentemente dimostrato¹⁷. Q...

Discussione

L'uso del modello Drosophila per lo studio del metabolismo cerebrale è relativamente nuovo²⁶ ed è stato dimostrato che condivide più caratteristiche con il metabolismo dei mammiferi di quanto ci si aspettasse, che è stato studiato principalmente in vitro in colture di neuroni primari o fette di cervello. La Drosophila eccelle negli esperimenti in vivo grazie alla batteria di strumenti genetici e sensori geneticamente codificati disponibili che consentono ai ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-