使用基因编码传感器在 离体果蝇 幼虫大脑中可视化单羧酸盐和其他相关代谢物

摘要

在这里，我们提出了一种方案，在 离体果蝇 幼虫脑制剂中使用基于基因编码的 Förster 共振能量转移传感器来可视化神经胶质细胞和神经元中单羧酸盐、葡萄糖和 ATP 的转运。

摘要

由于电活动导致的大脑的高能量需求是它们最显着的特征之一。通过从葡萄糖及其代谢物（如乳酸单羧酸盐和丙酮酸）生产ATP来满足这些要求。目前尚不清楚这一过程是如何被监管的，或者谁是关键参与者，特别是在 果蝇中。

使用基因编码的基于Förster共振能量转移的传感器，我们提出了一种简单的方法，用于测量离 体果蝇 幼虫脑制剂中神经胶质细胞和神经元中单羧酸盐和葡萄糖的转运。该协议描述了如何解剖并粘附在玻璃盖玻片上表达其中一个传感器的幼虫大脑。

我们展示了整个实验的结果，其中通过敲除神经胶质细胞中先前鉴定的单羧酸转运蛋白来测量幼虫大脑中的乳酸转运。此外，我们还演示了如何快速增加神经元活动并跟踪活跃大脑中的代谢物变化。所描述的方法提供了所有必要的信息，可用于分析其他 果蝇 活组织。

引言

由于神经元电信号的产生和传输以及突触传递引起的神经元中恢复离子梯度的成本很高，因此大脑具有很高的能量需求 ^1,2。长期以来，人们一直认为葡萄糖的持续氧化以产生ATP³可以满足这种高能量需求。血脑屏障处的特异性转运蛋白将血液中的葡萄糖转移到大脑。恒定的血糖水平确保大脑获得稳定的葡萄糖^{供应 4}.有趣的是，越来越多的实验证据表明，源自葡萄糖代谢的分子，如乳酸和丙酮酸，在脑细胞的能量产生中起着重要作用^5,6。然而，关于这些分子对能量产生的重要性以及大脑中的哪些细胞产生或使用它们仍然存在一些争论 ^7,8。缺乏这项任务所需的具有高时间和空间分辨率的适当分子工具是一个重要问题，阻碍了这一争议的完全解决。

几种工程荧光代谢传感器的开发和应用使我们对代谢物的产生和使用地点和方式以及代谢通量在基础和高神经元活动期间如何发生的理解显着增加⁹。基于Förster共振能量转移（FRET）显微镜的基因编码代谢传感器，如ATeam（ATP）、FLII¹²Pglu700μδ6（葡萄糖）、Laconic（乳酸）和Pyronac（丙酮酸），有助于我们对脑能量代谢^的理解10,11,12,13。然而，由于在活体动物或组织上进行实验所需的高成本和复杂设备，脊椎动物模型的结果仍然主要局限于细胞培养物（神经胶质细胞和神经元）。

果蝇模型表达这些传感器的新兴使用表明，关键的代谢特征在物种之间是保守的，并且可以使用该工具轻松解决其功能。更重要的是，果蝇模型揭示了葡萄糖和乳酸/丙酮酸如何在果蝇大脑中运输和代谢，单羧酸盐消耗与记忆形成之间的联系，以及神经活动和代谢通量的增加如何重叠的显着证明14,15,16,17.这里介绍的方法是使用幼虫大脑中表达的基因编码的FRET传感器来测量单羧酸盐，葡萄糖和ATP水平，使研究人员能够更多地了解果蝇的大脑如何使用能量，这些能量可以应用于其他动物的大脑。

我们发现该方法可有效检测神经胶质细胞和神经元中的乳酸和葡萄糖，并且单羧酸转运蛋白（Chaski）参与乳酸输入神经胶质细胞。我们还展示了一种简单的方法，用于研究神经元活动增加期间代谢物的变化，这可以通过GABA_A 受体拮抗剂的沐浴应用轻松诱导。最后，我们表明该方法可用于测量其他代谢重要组织（如脂肪体）中的单羧酸盐和葡萄糖转运。

研究方案

1.苍蝇菌株维护和幼虫同步

1. 为了进行这些实验，在由10%酵母，8%葡萄糖，5%小麦粉，1.1%琼脂，0.6%丙酸和1.5%尼泊金甲酯组成的标准 果蝇 食品上使用在25°C下培养的苍蝇培养物。
2. 要遵循此协议，请使用以下行: w¹¹¹⁸ （实验控制背景），OK6-GAL4（运动神经元的驱动程序），repo-GAL4（所有神经胶质细胞的驱动程序），CG-GAL4（脂肪体的驱动程序），UAS-Pyronic（丙酮酸传感器），UAS-FLII¹²Pglu700μδ6（葡萄糖传感器），UAS-Laconic（乳酸传感器），UAS-GCaMP6f（钙传感器），UAS-AT1.03NL（ATP传感器）和UAS-Chk RNAi GD1829。所有表达传感器或 RNAi 的品系都处于 w¹¹¹⁸ 遗传背景中。
3. 为了获得同步的三龄流浪幼虫，将300只所需遗传杂交的苍蝇（3-5天龄，100只雄性，200只处女雌性）放入产卵室中，该产卵室包含一个60毫米的培养皿，上面覆盖着1%琼脂糖在磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中。在斑块中心放置一滴液体/奶油酵母（直径1.5厘米），以鼓励苍蝇产卵（图1）。
4. 将果蝇保持在25°C下3天，用新鲜的培养皿和新鲜溶解的酵母代替琼脂糖培养皿，每天两次。
5. 在更换培养皿之前，让苍蝇在第四天产卵4小时。去除此斑块。然后，3小时，让苍蝇在新的琼脂糖斑块中产卵，并带有新鲜溶解的酵母。在实验中使用这些幼虫。
6. 3小时后，除去含有鸡蛋的斑块，并将其置于25°C培养箱中24小时。
7. 从该斑块中收集50至100只新孵化的幼虫（幼虫孵化后0小时），并将它们放入装有标准食物的塑料瓶中。为了让幼虫正常进食，请确保食物磨碎且柔软。转移后96小时使用幼虫。

2.用聚-L-赖氨酸制作玻璃盖玻片

1. 在幼虫解剖前1小时执行此步骤。在6孔细胞培养板中，放置25mm玻璃盖玻片（要使用的盖子的直径取决于显微镜中可用的记录室）。
2. 在室温下将一滴（300μL）聚-L-赖氨酸放在每个盖玻片的中心30分钟。
3. 用蒸馏水洗涤每个盖玻片3次，然后用不含Ca²⁺ 的盐水溶液洗涤2次（与用于解剖幼虫的溶液相同，参见步骤3.2）。将盖子安装在记录室中，并用不含 Ca²⁺ 的盐水溶液填充。
   注意:虽然幼虫脑可以直接粘附在玻璃盖玻片上，但粘附性较弱，并且由于盐水溶液的连续流动，在实验过程中大脑偶尔会移动或移位。添加聚-L-赖氨酸步骤可降低因洗涤而导致的运动甚至脑损失的风险。

3. 解剖腹侧神经索 （VNC） 和脂肪体 （FB）

1. 从所需的遗传杂交（从步骤1.7开始）收集游荡的三龄幼虫，并用蒸馏水彻底清洗它们3次。
2. 将幼虫置于含有750μL标称零Ca²⁺冰冷盐水溶液的玻璃解剖皿孔中，该溶液由128mM NaCl，2mM KCl，4mM MgCl 2,5mM海藻糖，5mM HEPES和35mM蔗糖组成（pH = 6.7，用pH计测量并用1M NaOH和HCl 37% v / v调节）。
   注意:将pH值设置为6.7至关重要，因为如前所述，单羧酸盐转运高度依赖于溶液的pH值。此外，6.7对应于三龄幼虫^17,18的血淋巴中的pH值。
3. 将幼虫置于立体显微镜下，并用一把镊子在腹部后部横切。
4. 用镊子推动下颚，同时将幼虫翻过来。
5. 观察下颌旁边的腹侧神经索 （VNC）。小心地取出假想的椎间盘和剩余的脑尾部组织。
6. 通过切断神经，将具有中枢脑和视叶的VNC与其他组织分开。转移VNC，用镊子从剩余的神经中取出它，并将其放入含有无Ca²⁺记录溶液的记录室中（与步骤3.2相同的溶液）。VNC 将立即粘附在盖玻片上。
7. 为避免来自其余神经的干扰，请使用镊子将它们连接到盖玻片的底部（神经也将根据所使用的驱动线发出荧光）（图2）。
8. 要在另一组实验中测量葡萄糖或单羧酸盐转运的脂肪体（FBs）进行实验，请按照步骤3.1-3.4继续分离组织。一旦幼虫被翻过来，观察FB是一个白色的、双侧的、扁平的组织。
9. 将表达FRET传感器的分离FB（使用适当的驱动器从遗传杂交中获得）放入含有不含Ca²⁺的记录溶液的记录室中。
   注意:FB具有高度疏水性（它倾向于漂浮在溶液表面），并且极易被镊子操作，必须小心处理。对这种组织的任何粗暴处理都会导致以后的死细胞（传感器的荧光降低）。
10. 将含有VNC / FB的记录室放在显微镜载物台上。

4. 活细胞成像

1. 要获取表达组织的传感器的图像，请使用与发射分流系统和 CCD 相机耦合的正置荧光显微镜。在开始任何实验前30分钟打开显微镜的照明系统。
   注意:在这里，我们使用配备20x/0.5水浸物镜的转盘荧光显微镜来观察VNC和FB。 图 2 还显示了40x/0.8水浸物镜的使用。
2. 要可视化 GCaMP6f 荧光，请将 激发 和 发射 波长分别设置为 488 nm 和 540 nm。对于Laconic/Pyronic/ATP/葡萄糖传感器，将 激发 波长设置为 440 nm ， 将发射 波长设置为 488 nm （mTFP，CFP）和 540 nm （Venus，YFP）。
3. GCaMP6f 每 2 秒采集 512 x 512 像素大小的图像，Laconic/Pyronic/ATP/葡萄糖传感器每 10-30 秒采集一次图像。通过观察所获得的图像质量，确定对光源的最佳曝光。要遵循此协议，请确保 Laconic 和 Pyronic 传感器的图像曝光时间为 300 ms，葡萄糖和 ATP 传感器的图像曝光为 100-150 ms。
   注意:曝光可能因共聚焦或普通荧光显微镜的使用而异。
4. 将记录室安装在显微镜载物台中后，小心放置水浸物镜，并确保物镜在整个实验过程中保持浸没状态。将室温保持在25°C。
5. 将记录室连接到灌注系统，并将组织浸泡在含有128mM NaCl，2mM KCl，1.5mM CaCl 2,4mM MgCl 2,5mM海藻糖，5mM HEPES和35mM蔗糖的记录溶液中，pH 6.7（用pH计测量并用NaOH和HCl调节）。
6. 使用重力保持 3 mL/min 的记录溶液通过组织的恒定流量，与低通量蠕动泵耦合，以在保持体积恒定的同时从腔室中提取液体。为了达到所需的流量，将含溶液的试管（50 mL 塑料管）放置在显微镜载物台上方 25 cm 处。
   注意:这种重力驱动的流动用于防止蠕动泵引起的组织运动，以便以后进行更准确的图像分析。
7. 在进行任何刺激之前，保持记录溶液流动5-10分钟，以从传感器获得稳定的荧光基线。根据需要更改持续时间以获取此基线。
8. 用刺激溶液代替流动溶液5分钟以刺激VNC / FBs（用葡萄糖，丙酮酸或乳酸，其浓度溶解在盐水溶液中，每个实验所述的浓度;见每个图）。
   注意:刺激的持续时间可以根据实验的需要而改变（例如，葡萄糖脉冲可以增加到10分钟以达到神经元的平台，如先前报道^的16）。
9. 为了保持刺激溶液中的渗透压，根据添加的单羧酸盐或葡萄糖的浓度，纠正蔗糖浓度（ 果蝇 大脑不可代谢的碳水化合物）。
10. 使用简单的阀门系统改变解决方案。注意不要移动显微镜载物台。
11. 将VNC暴露于80μMpicrotoxin（PTX，连续流动）以刺激神经元活动。该过程增加了 Ca²⁺ 振荡的频率，从而可以观察到代谢相关分子（例如细胞内 ATP）的变化。
12. 在任何实验结束时，用盐水彻底清洗整个流动系统，包括试管和记录室至少10分钟，再用蒸馏水清洗10分钟，以消除所用溶液的任何痕迹。

5. 图像处理和数据分析

1. 要处理获得的图像，请继续执行 图 3 中所示的步骤。
2. 将图像（简洁）导入 ImageJ 软件。该图像有两个样本视图:左边是 mTFP 信号，右边是金星信号。选择包含要分析的细胞的区域，并在新窗口中分离这些图像（mTFP 和 Venus）。确保这些图像包含完全相同的区域。
3. 打开配准插件，校正通常在实验中观察到的组织的小漂移，使用函数刚体。在两个图像（mTFP 和 Venus）中执行此操作。
4. 在 mTFP 信号 （488 nm） 中相应 10 个细胞的胞质溶胶中选择至少 10 个感兴趣区域 （ROI），并将选择转移到 Venus （540 nm） 图像中。
5. 选择两个或三个靠近被分析细胞但没有可辨别信号的ROI（始终在VNC或分析的组织内，见 图3）。这些是背景投资回报率。
6. 在两个图像中都选择了 ROI 后，使用函数度量获得每个信号的平均灰度值。将数据传输到数据手册中，并减去每个信号的平均背景值。
7. 确定 Venus 的 mTFP 荧光比（对于 Laconic 和 Pyronic）。该值的计算方式与此处描述的其他FRET传感器（其比率通常为YFP/CFP）不同，因为当与各自的基板结合时，Laconic和Pyronic都会降低其FRET效率。
8. 规范化数据，将每个记录值除以基线。在单独的数据表中，通过取刺激前 2 分钟内 mTFP/Venus 比率的平均值来计算基线。
9. 对于使用基于FRET的传感器进行葡萄糖和ATP测量，计算YFP / CFP比率，并按照步骤5.8中所述对数据进行归一化。

结果

在长达1小时的时间内，该过程可以很容易地测量单羧酸盐和葡萄糖传感器荧光的细胞内变化。如 图 4 所示，神经胶质细胞和运动神经元中的简洁传感器在脉冲开始时以相似的速率响应 1 mM 乳酸，但在 5 分钟脉冲期间运动神经元比基线达到更高的增加，如前所述¹⁷。之所以选择这种乳酸浓度，是因为它与三龄幼虫血淋巴中发现的水平相当。同样，当表达 VNC ?...

讨论

使用 果蝇 模型研究脑代谢相对较新²⁶，并且已被证明与哺乳动物代谢共享的特征比预期的要多，这主要是在体 外 的原代神经元培养物或脑切片中研究的。 果蝇 擅长 体内 实验，这要归功于一系列可用的遗传工具和基因编码传感器，使研究人员能够实时可视化由诱导活动甚至对感官刺激的反应引起的代谢变化。

此处描述的方案显?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-