使用基因编码传感器在 离体果蝇 幼虫大脑中可视化单羧酸盐和其他相关代谢物

摘要

在这里，我们提出了一种方案，在 离体果蝇 幼虫脑制剂中使用基于基因编码的 Förster 共振能量转移传感器来可视化神经胶质细胞和神经元中单羧酸盐、葡萄糖和 ATP 的转运。

摘要

由于电活动导致的大脑的高能量需求是它们最显着的特征之一。通过从葡萄糖及其代谢物（如乳酸单羧酸盐和丙酮酸）生产ATP来满足这些要求。目前尚不清楚这一过程是如何被监管的，或者谁是关键参与者，特别是在 果蝇中。

使用基因编码的基于Förster共振能量转移的传感器，我们提出了一种简单的方法，用于测量离 体果蝇 幼虫脑制剂中神经胶质细胞和神经元中单羧酸盐和葡萄糖的转运。该协议描述了如何解剖并粘附在玻璃盖玻片上表达其中一个传感器的幼虫大脑。

我们展示了整个实验的结果，其中通过敲除神经胶质细胞中先前鉴定的单羧酸转运蛋白来测量幼虫大脑中的乳酸转运。此外，我们还演示了如何快速增加神经元活动并跟踪活跃大脑中的代谢物变化。所描述的方法提供了所有必要的信息，可用于分析其他 果蝇 活组织。

引言

由于神经元电信号的产生和传输以及突触传递引起的神经元中恢复离子梯度的成本很高，因此大脑具有很高的能量需求 ^1,2。长期以来，人们一直认为葡萄糖的持续氧化以产生ATP³可以满足这种高能量需求。血脑屏障处的特异性转运蛋白将血液中的葡萄糖转移到大脑。恒定的血糖水平确保大脑获得稳定的葡萄糖^{供应 4}.有趣的是，越来越多的实验证据表明，源自葡萄糖代谢的分子，如乳酸和丙酮酸，在脑细胞的能量产生中起着重要作用^5,6。然而，关于这些分子对能量产生的重要性以及大脑中的哪些细胞产生或使用它们仍然存在一些争论 ^7,8。缺乏这项任务所需的具有高时间和空间分辨率的适当分子工具是一个重要问题，阻碍了这一争议的完全解决。

几种工程荧光代谢传感器的开发和应用使我们对代谢物的产生和使用地点和方式以及代谢通量在基础和高神经元活动期间如何发生的理解显着增加⁹。基于Förster共振能量转移（FRET）显微镜的基因编码代谢传感器....

研究方案

1.苍蝇菌株维护和幼虫同步

1. 为了进行这些实验，在由10%酵母，8%葡萄糖，5%小麦粉，1.1%琼脂，0.6%丙酸和1.5%尼泊金甲酯组成的标准 果蝇 食品上使用在25°C下培养的苍蝇培养物。
2. 要遵循此协议，请使用以下行： w¹¹¹⁸ （实验控制背景），OK6-GAL4（运动神经元的驱动程序），repo-GAL4（所有神经胶质细胞的驱动程序），CG-GAL4（脂肪体的驱动程序），UAS-Pyronic（丙酮酸传感器），UAS-FLII¹²Pglu700μδ6（葡萄糖传感器），UAS-Laconic（乳酸传感器），UAS-GCaMP6f（钙传感器），UAS-AT1.03NL（ATP传感器）和UAS-Chk RNAi GD1829。所有表达传感器或 RNAi 的品系都处于 w¹¹¹⁸ 遗传背景中。
3. 为了获得同步的三龄流浪幼虫，将300只所需遗传杂交的苍蝇（3-5天龄，100只雄性，200只处女雌性）放入产卵室中，该产卵室包含一个60毫米的培养皿，上面覆盖着1%琼脂糖在磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中。在斑块中心放置一滴液体/奶油酵母（直径1.5厘米），以鼓励苍蝇产卵（图1）。
4. 将果蝇保持在25°C下3天，用新鲜的培养皿和新鲜溶解的酵母代替琼脂糖培养皿....

讨论

使用 果蝇 模型研究脑代谢相对较新²⁶，并且已被证明与哺乳动物代谢共享的特征比预期的要多，这主要是在体 外 的原代神经元培养物或脑切片中研究的。 果蝇 擅长 体内 实验，这要归功于一系列可用的遗传工具和基因编码传感器，使研究人员能够实时可视化由诱导活动甚至对感官刺激的反应引起的代谢变化。

此处描述的方案显?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-