Visualisierung von Monocarboxylaten und anderen relevanten Metaboliten im ex vivo Drosophila-Larvengehirn mit genetisch kodierten Sensoren

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Transport von Monocarboxylaten, Glukose und ATP in Gliazellen und Neuronen unter Verwendung genetisch kodierter Förster-Resonanzenergietransfer-basierter Sensoren in einer ex-vivo-Drosophila-Larvenhirnpräparation zu visualisieren.

Zusammenfassung

Der hohe Energiebedarf des Gehirns aufgrund der elektrischen Aktivität ist eines seiner charakteristischsten Merkmale. Dieser Bedarf wird durch die Herstellung von ATP aus Glukose und ihren Metaboliten, wie den Monocarboxylaten Lactat und Pyruvat, gedeckt. Es ist noch unklar, wie dieser Prozess reguliert wird oder wer die Hauptakteure sind, insbesondere bei Drosophila.

Mit Hilfe genetisch kodierter Förster-Resonanzenergietransfer-basierter Sensoren stellen wir eine einfache Methode zur Messung des Transports von Monocarboxylaten und Glukose in Gliazellen und Neuronen in einer ex-vivo Drosophila-Larvenhirnpräparation vor. Das Protokoll beschreibt, wie ein Larvengehirn, das einen der Sensoren exprimiert, auf einem Glasdeckglas seziert und befestigt wird.

Wir präsentieren die Ergebnisse eines ganzen Experiments, in dem der Laktattransport in Larvengehirnen gemessen wurde, indem zuvor identifizierte Monocarboxylattransporter in Gliazellen ausgeschaltet wurden. Darüber hinaus zeigen wir, wie die neuronale Aktivität schnell erhöht und Metabolitenveränderungen im aktiven Gehirn verfolgt werden können. Die beschriebene Methode, die alle notwendigen Informationen liefert, kann zur Analyse anderer lebender Gewebe von Drosophila verwendet werden.

Einleitung

Das Gehirn hat einen hohen Energiebedarf aufgrund der hohen Kosten für die Wiederherstellung von Ionengradienten in Neuronen, die durch neuronale elektrische Signalerzeugung und -übertragung sowie synaptische Übertragung verursacht^{werden 1,2}. Lange Zeit wurde angenommen, dass dieser hohe Energiebedarf durch die kontinuierliche Oxidation von Glukose zur Herstellung von ATP³ gedeckt wird. Spezifische Transporter an der Blut-Hirn-Schranke übertragen die Glukose im Blut ins Gehirn. Konstante glykämische Werte sorgen dafür, dass das Gehirn eine stetige Versorgung mit Glukose^{erhält 4}. Interessanterweise deuten wachsende experimentelle Beweise darauf hin, dass Moleküle, die aus dem Glukosestoffwechsel stammen, wie Laktat und Pyruvat, eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion der Gehirnzellen spielen ^5,6. Es gibt jedoch immer noch einige Diskussionen darüber, wie wichtig diese Moleküle für die Energiegewinnung sind und welche Zellen im Gehirn sie produzieren oder verwenden ^7,8. Der Mangel an geeigneten molekularen Werkzeugen mit der für diese Aufgabe erforderlichen hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung ist ein wichtiges Problem, das eine vollständige Lösung dieser Kontroverse verhindert hat.

Die Entwicklung und Anwendung mehrerer technisch hergestellter fluoreszierender Stoffwechselsensoren hat zu einem bemerkenswerten Verständnis unseres Verständnisses geführt, wo und wie Metaboliten produziert und verwendet werden und wie die Stoffwechselflüsse während der basalen und hohen neuronalen Aktivität auftreten⁹. Genetisch kodierte Stoffwechselsensoren, die auf der Förster-Resonanzenergietransfer-Mikroskopie (FRET) basieren, wie ATeam (ATP), FLII¹²Pglu700μδ6 (Glukose), Lakonisch (Laktat) und Pyronisch (Pyruvat), haben zu unserem Verständnis des Energiestoffwechsels im Gehirn beigetragen 10,11,12,13. Aufgrund der hohen Kosten und der ausgeklügelten Geräte, die für die Durchführung von Experimenten an lebenden Tieren oder Geweben erforderlich sind, beschränken sich die Ergebnisse in Wirbeltiermodellen jedoch immer noch hauptsächlich auf Zellkulturen (Gliazellen und Neuronen).

Die aufkommende Verwendung des Drosophila-Modells zur Expression dieser Sensoren hat gezeigt, dass wichtige Stoffwechselmerkmale artenübergreifend erhalten sind und ihre Funktion mit diesem Werkzeug leicht angegangen werden kann. Noch wichtiger ist, dass das Drosophila-Modell Aufschluss darüber gegeben hat, wie Glukose und Laktat/Pyruvat im Fliegengehirn transportiert und metabolisiert werden, den Zusammenhang zwischen Monocarboxylatkonsum und Gedächtnisbildung und die bemerkenswerte Demonstration, wie sich Steigerungen der neuronalen Aktivität und des Stoffwechselflusses überlappen 14,15,16,17. Die hier vorgestellte Methode zur Messung des Monocarboxylat-, Glukose- und ATP-Spiegels mit genetisch kodierten FRET-Sensoren, die im Larvengehirn exprimiert werden, ermöglicht es den Forschern, mehr darüber zu erfahren, wie das Gehirn von Drosophila Energie verbraucht, die auf die Gehirne anderer Tiere angewendet werden kann.

Wir zeigen, dass diese Methode für den Nachweis von Laktat und Glukose in Gliazellen und Neuronen wirksam ist und dass ein Monocarboxylattransporter (Chaski) am Laktatimport in Gliazellen beteiligt ist. Wir demonstrieren auch eine einfache Methode zur Untersuchung von Metabolitenveränderungen bei erhöhter neuronaler Aktivität, die leicht durch Badapplikation eines GABA-A-Rezeptor-Antagonisten induziert werden kann. Schließlich zeigen wir, dass diese Methodik verwendet werden kann, um den Monocarboxylat- und Glukosetransport in anderen metabolisch bedeutsamen Geweben, wie z.B. Fettkörpern, zu messen.

Protokoll

1. Aufrechterhaltung des Fliegenstamms und Larvensynchronisation

1. Um diese Experimente durchzuführen, verwenden Sie Fliegenkulturen, die bei 25 °C auf Standard-Drosophila-Futter aufgezogen wurden, das aus 10 % Hefe, 8 % Glukose, 5 % Weizenmehl, 1,1 % Agar, 0,6 % Propionsäure und 1,5 % Methylparaben besteht.
2. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die folgenden Zeilen: w¹¹¹⁸ (experimenteller Kontrollhintergrund), OK6-GAL4 (Treiber für Motoneuronen), repo-GAL4 (Treiber für alle Gliazellen), CG-GAL4 (Treiber für Fettkörper), UAS-Pyronic (Pyruvatsensor), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (Glukosesensor), UAS-Laconic (Laktatsensor), UAS-GCaMP6f (Kalziumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-Sensor) und UAS-Chk RNAi GD1829. Alle Linien, die Sensoren oder RNAi exprimieren, befinden sich im genetischen Hintergrund von w¹¹¹⁸ .
3. Um synchronisierte wandernde Larven des dritten Stadiums zu erhalten, legen Sie 300 Fliegen (3-5 Tage alt, 100 Männchen, 200 jungfräuliche Weibchen) der gewünschten genetischen Kreuzung in die Eiablagekammer, die eine 60-mm-Petrischale enthält, die mit 1% Agarose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bedeckt ist. Geben Sie einen Tropfen flüssige/cremige Hefe (1,5 cm Durchmesser) in die Mitte der Plaque, um die Fliegen zur Eiablage zu ermutigen (Abbildung 1).
4. Halten Sie die Fliegen 3 Tage lang bei 25 °C und ersetzen Sie die Agarose-Petrischale zweimal täglich durch eine frische und frisch aufgelöste Hefe.
5. Lassen Sie die Fliegen am vierten Tag 4 Stunden Eier legen, bevor Sie die Petrischale wechseln. Entfernen Sie diese Plakette. Lassen Sie die Fliegen dann 3 Stunden lang Eier in eine neue Agarose-Plaque mit frisch aufgelöster Hefe legen. Verwenden Sie diese Larven in den Experimenten.
6. Entfernen Sie nach 3 Stunden die Plaque mit den Eiern und legen Sie sie für 24 Stunden in einen 25 °C heißen Inkubator.
7. Sammeln Sie 50 bis 100 frisch geschlüpfte Larven aus dieser Plaque (0 h nach dem Schlüpfen der Larven) und legen Sie sie in ein Plastikfläschchen mit Standardfutter. Damit sich die Larven richtig ernähren können, stellen Sie sicher, dass das Futter gemahlen und weich ist. Verwenden Sie die Larven 96 h nach dem Transfer.

2. Glasdeckgläser mit Poly-L-Lysin herstellen

1. Führen Sie diesen Schritt 1 h vor der Larvendissektion durch. Legen Sie in eine 6-Well-Zellkulturplatte 25 mm Glasdeckgläser (der Durchmesser der zu verwendenden Abdeckungen hängt von der im Mikroskop verfügbaren Aufnahmekammer ab).
2. Geben Sie einen Tropfen (300 μl) Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur in die Mitte jedes Deckglases.
3. Waschen Sie jedes Deckglas 3x mit destilliertem Wasser, dann 2x mit einer Kochsalzlösung ohne Ca²⁺ (die gleiche Lösung, die zum Sezieren der Larven verwendet wird, siehe Schritt 3.2). Installieren Sie die Abdeckungen in der Aufnahmekammer und füllen Sie sie mit Ca²⁺-freier Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Obwohl das Larvengehirn direkt an den Glasdeckgläsern haften kann, ist die Haftung schwach und das Gehirn bewegt oder verschiebt sich während des Experiments gelegentlich aufgrund des kontinuierlichen Flusses von Kochsalzlösung. Die Zugabe der Poly-L-Lysin-Stufe reduziert das Risiko von Bewegungen oder sogar Hirnverlust als Folge der Wäschen.

3. Präparieren Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) und die Fettkörper (FBs)

1. Sammeln Sie die wandernden Larven des dritten Stadiums aus der gewünschten genetischen Kreuzung (aus Schritt 1.7) und waschen Sie sie 3x gründlich mit destilliertem Wasser.
2. Legen Sie die Larven in eine gläserne Sezierschale mit 750 μl nominell null Ca²⁺ eiskalter Kochsalzlösung, bestehend aus 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES und 35 mM Saccharose (pH = 6,7, gemessen mit einem pH-Messgerät und eingestellt mit 1 M NaOH und HCl 37% v/v).
   HINWEIS: Die Einstellung des pH-Werts auf 6,7 ist von entscheidender Bedeutung, da der Monocarboxylattransport, wie bereits erwähnt, stark vom pH-Wert der Lösung abhängt. Darüber hinaus entspricht 6,7 dem pH-Wert in der Hämolymphe einer Larve im dritten Stadium^17,18.
3. Legen Sie die Larve unter ein Stereomikroskop und machen Sie mit einer Pinzette einen Querschnitt über die Rückseite des Bauches.
4. Drücken Sie mit der Pinzette auf den Kiefer, während Sie die Larven von innen nach außen drehen.
5. Beobachten Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) neben dem Kiefer. Entfernen Sie vorsichtig die Imaginalscheiben und das verbleibende Gehirn-Schwanzgewebe.
6. Trennen Sie das VNC mit dem Zentralhirn und den Sehlappen vom Rest des Gewebes, indem Sie die Nerven durchtrennen. Übertragen Sie das VNC, nehmen Sie es mit einer Pinzette von den verbleibenden Nerven auf und legen Sie es in die Aufnahmekammer, in der sich die Ca²⁺-freie Aufnahmelösung befindet (gleiche Lösung aus Schritt 3.2). Die VNCs haften sofort auf den Deckgläsern.
7. Um Störungen durch die verbleibenden Nerven zu vermeiden, befestigen Sie sie mit einer Pinzette am unteren Rand des Deckglases (die Nerven werden je nach verwendeter Treiberleine auch fluoreszieren) (Abbildung 2).
8. Um Experimente an Fettkörpern (FBs) durchzuführen, die den Glukose- oder Monocarboxylattransport in einer anderen Versuchsreihe messen, isolieren Sie die Gewebe gemäß den Schritten 3.1-3.4. Sobald die Larven von innen nach außen gedreht sind, beachten Sie, dass das FB ein weißes, beidseitiges, flaches Gewebe ist.
9. Platzieren Sie die isolierten FBs, die die FRET-Sensoren exprimieren (aus einer genetischen Kreuzung mit den entsprechenden Treibern) in der Aufnahmekammer, die die Aufzeichnungslösung ohne Ca²⁺ enthält.
   HINWEIS: Der FB ist stark hydrophob (er neigt dazu, auf der Oberfläche der Lösung zu schwimmen) und extrem anfällig für Manipulationen mit Pinzetten, er muss mit Vorsicht behandelt werden. Jede grobe Behandlung dieses Gewebes führt später zu abgestorbenen Zellen (mit einer verminderten Fluoreszenz der Sensoren).
10. Stellen Sie die Aufnahmekammer mit VNCs/FBs auf den Mikroskoptisch.

4. Lebendzell-Bildgebung

1. Um Bilder der gewebeexprimierenden Sensoren aufzunehmen, verwenden Sie ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Emissionsspaltungssystem und einer CCD-Kamera gekoppelt ist. Schalten Sie das Beleuchtungssystem des Mikroskops 30 Minuten vor Beginn eines Experiments ein.
   HINWEIS: Hier verwenden wir ein Spinning-Disk-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20x/0,5-Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist, um sowohl VNCs als auch FBs zu beobachten. Abbildung 2 zeigt auch die Verwendung eines 40x/0,8-Wasserimmersionsobjektivs.
2. Um die GCaMP6f-Fluoreszenz zu visualisieren, stellen Sie die Anregungs - und Emissionswellenlängen auf 488 nm bzw. 540 nm ein. Stellen Sie für lakonische/pyronische/ATP/Glukosesensoren die Anregungswellenlänge auf 440 nm und die Emissionswellenlängen auf 488 nm (mTFP, CFP) und 540 nm (Venus, YFP) ein.
3. Erfassen Sie alle 2 s Bilder mit einer Größe von 512 x 512 Pixeln für GCaMP6f und alle 10-30 s für lakonische/pyronische/ATP/Glukosesensoren. Bestimmen Sie die optimale Belichtung der Lichtquelle unter Beobachtung der Qualität des erhaltenen Bildes. Um dieses Protokoll zu befolgen, stellen Sie sicher, dass die Bilder eine Belichtungszeit von 300 ms für lakonische und pyronische Sensoren und 100-150 ms für die Glukose- und ATP-Sensoren haben.
   HINWEIS: Die Belichtung kann je nach Verwendung eines konfokalen oder normalen Fluoreszenzmikroskops variieren.
4. Sobald die Aufnahmekammer in der Bühne des Mikroskops installiert ist, setzen Sie das Wasserimmersionsobjektiv vorsichtig ein und stellen Sie sicher, dass das Objektiv während des gesamten Experiments untergetaucht bleibt. Halten Sie die Raumtemperatur bei 25 °C.
5. Schließen Sie die Aufnahmekammer an ein Perfusionssystem an und halten Sie das Gewebe in der Aufnahmelösung gebadet, die 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES und 35 mM Saccharose, pH 6,7 (gemessen mit einem pH-Messgerät und eingestellt mit NaOH und HCl) enthält.
6. Halten Sie einen konstanten Fluss von 3 ml/min Aufnahmelösung durch das Gewebe unter Verwendung der Schwerkraft aufrecht, gekoppelt an eine Peristaltikpumpe mit geringem Fluss, um die Flüssigkeit aus der Kammer zu extrahieren und gleichzeitig das Volumen konstant zu halten. Um den erforderlichen Durchfluss zu erreichen, positionieren Sie die lösungshaltigen Röhrchen (50 ml-Kunststoffröhrchen) 25 cm über dem Mikroskoptisch.
   HINWEIS: Diese schwerkraftgetriebene Strömung wird verwendet, um Gewebebewegungen zu verhindern, die durch Peristaltikpumpen verursacht werden, was später eine genauere Bildanalyse ermöglicht.
7. Lassen Sie die Aufnahmelösung vor jeder Stimulation 5-10 Minuten lang fließen, um eine stabile Basislinie der Fluoreszenz von den Sensoren zu erhalten. Ändern Sie die Dauer nach Bedarf, um diese Baseline zu erhalten.
8. Ersetzen Sie die fließende Lösung 5 Minuten lang durch die Stimulationslösung, um die VNC/FBs zu stimulieren (mit Glukose, Pyruvat oder Laktat in der für jedes Experiment beschriebenen Konzentration, gelöst in Kochsalzlösung; siehe jede Abbildung).
   HINWEIS: Die Dauer der Stimulation kann je nach den Anforderungen des Experiments variiert werden (z. B. können Glukoseimpulse auf 10 Minuten erhöht werden, um ein Plateau in Neuronen zu erreichen, wie zuvor berichtet¹⁶).
9. Um die Osmolarität in der Stimulationslösung aufrechtzuerhalten, korrigieren Sie die Saccharosekonzentration (ein Kohlenhydrat, das vom Drosophila-Gehirn nicht metabolisiert werden kann) entsprechend der Konzentration des zugesetzten Monocarbonylats oder der Glukose.
10. Ändern Sie die Lösungen mit einem einfachen Ventilsystem. Achten Sie darauf, den Mikroskoptisch nicht zu bewegen.
11. Setzen Sie den VNC 80 μM Picrotoxin (PTX, kontinuierlich fließend) aus, um die neuronale Aktivität zu stimulieren. Dieses Verfahren erhöht die Frequenz von Ca2⁺ -Oszillationen, wodurch Veränderungen in metabolisch relevanten Molekülen (z.B. intrazelluläres ATP) beobachtet werden können.
12. Am Ende eines jeden Versuchs wird das gesamte Durchflusssystem, einschließlich der Röhrchen und der Aufnahmekammer, mindestens 10 Minuten lang mit der Kochsalzlösung und weitere 10 Minuten mit destilliertem Wasser gründlich gewaschen, um alle Spuren der verwendeten Lösungen zu entfernen.

5. Bildverarbeitung und Datenanalyse

1. Um die erhaltenen Bilder zu verarbeiten, fahren Sie mit den in Abbildung 3 gezeigten Schritten fort.
2. Importieren Sie das Bild (Lakonisch) in die ImageJ-Software. Das Bild zeigt zwei Ansichten der Probe: Die linke ist das mTFP-Signal und die rechte ist das Venussignal. Wählen Sie eine Region aus, die die zu analysierenden Zellen enthält, und trennen Sie diese Bilder (mTFP und Venus) in einem neuen Fenster. Stellen Sie sicher, dass diese Bilder genau den gleichen Bereich enthalten.
3. Öffnen Sie das Registrierungs-Plugin und korrigieren Sie die kleine Drift des Gewebes, die normalerweise im Experiment mit der Funktion starrer Körper beobachtet wird. Führen Sie dies in beiden Bildern (mTFP und Venus) durch.
4. Wählen Sie mindestens 10 Regionen von Interesse (ROIs) im Zytosol der entsprechenden 10 Zellen im mTFP-Signal (488 nm) aus und übertragen Sie die Selektionen auf das Venusbild (540 nm).
5. Wählen Sie zwei oder drei ROIs in der Nähe der zu analysierenden Zellen, aber ohne erkennbares Signal (immer innerhalb des VNC oder des analysierten Gewebes, siehe Abbildung 3). Dies sind die Hintergrund-ROIs.
6. Wenn die ROIs in beiden Bildern ausgewählt sind, erhalten Sie den mittleren Grauwert jedes Signals mit der Funktion measure. Übertragen Sie die Daten in ein Datenblatt und subtrahieren Sie den durchschnittlichen Hintergrundwert für jedes Signal.
7. Bestimmen Sie das mTFP-Fluoreszenzverhältnis über Venus (für Lakonisch und Pyronisch). Dieser Wert wird anders berechnet als bei den anderen hier beschriebenen FRET-Sensoren (bei denen das Verhältnis normalerweise YFP/CFP ist), da sowohl Laconic als auch Pyronic ihre FRET-Effizienz reduzieren, wenn sie an ihre jeweiligen Substrate gebunden sind.
8. Normalisieren Sie die Daten, indem Sie jeden aufgezeichneten Wert durch die Baseline dividieren. Berechnen Sie in einem separaten Datenblatt die Baseline, indem Sie den Mittelwert des mTFP/Venus-Verhältnisses während der 2 Minuten vor dem Stimulus nehmen.
9. Berechnen Sie für die Glukose- und ATP-Messungen mit FRET-basierten Sensoren das YFP/CFP-Verhältnis und normalisieren Sie die Daten wie in Schritt 5.8 beschrieben.

Ergebnisse

Dieses Verfahren ermöglicht eine einfache Messung intrazellulärer Veränderungen in der Fluoreszenz von Monocarboxylat- und Glukosesensoren. Wie in Abbildung 4 gezeigt, reagieren lakonische Sensoren sowohl in Gliazellen als auch in Motoneuronen zu Beginn des Pulses mit einer ähnlichen Rate auf 1 mM Laktat, aber Motoneuronen erreichen während des 5-Minuten-Pulses einen höheren Anstieg gegenüber der Grundlinie, wie zuvor gezeigt¹⁷. Diese Laktatkonzentration wurde ...

Diskussion

Die Verwendung des Drosophila-Modells zur Untersuchung des Gehirnstoffwechsels ist relativ neu²⁶, und es hat sich gezeigt, dass es mehr Eigenschaften mit dem Stoffwechsel von Säugetieren teilt als erwartet, was hauptsächlich in vitro in primären Neuronenkulturen oder Hirnschnitten untersucht wurde. Drosophila zeichnet sich bei In-vivo-Experimenten dank der verfügbaren genetischen Werkzeuge und genetisch kodierten Sensoren aus, die es den Forschern ermöglich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-