الحفظ بالتبريد للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المرحلة المثلى

Summary

توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا للحفظ بالتبريد الفعال للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية.

Abstract

الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هي مصادر خلايا متفوقة للعلاج باستبدال الخلايا لدى الأفراد المصابين بأمراض تنكسية في شبكية العين. ومع ذلك ، فإن الدراسات حول البنوك المستقرة والآمنة لهذه الخلايا العلاجية نادرة. تعد قابلية بقاء الخلايا المتغيرة للغاية والاسترداد الوظيفي لخلايا RPE بعد الحفظ بالتبريد من أكثر المشكلات شيوعا. في البروتوكول الحالي ، كنا نهدف إلى تحقيق أفضل معدل لاستعادة الخلايا بعد الذوبان عن طريق اختيار مرحلة الخلية المثلى للتجميد بناء على الظروف التجريبية الأصلية. تم تجميد الخلايا في المرحلة الأسية المحددة باستخدام مقايسة وضع العلامات 5-ethynyl-2′-deoxyuridine ، مما أدى إلى تحسين صلاحية الخلية ومعدل الشفاء بعد الذوبان. تم الحصول على خلايا مستقرة ووظيفية بعد فترة وجيزة من ذوبان الجليد ، مستقلة عن عملية تمايز طويلة. تسمح الطرق الموضحة هنا بحفظ وذوبان خلايا RPE المشتقة من hESC بشكل بسيط وفعال وغير مكلف. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على خلايا RPE ، يمكن تطبيق استراتيجية التجميد هذه على العديد من الأنواع الأخرى من الخلايا المتمايزة.

Introduction

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية مصطبغة من الخلايا اللازمة للحفاظ على الوظيفة المناسبة للشبكية¹. يرتبط الخلل الوظيفي RPE والوفاة ارتباطا وثيقا بالعديد من الأمراض التنكسية للشبكية ، بما في ذلك التنكس البقعي المرتبط بالعمر والتهاب الشبكية الصباغي ومرض Stargardt ^2,3. العلاج ببدائل RPE هو واحد من أكثر أنظمة العلاج الواعدة لهذه الأمراض^4،5،6،7. يعد الإمداد المستقر بخلايا RPE المانحة أمرا حيويا للعلاج بالخلايا. تعد خلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية الجني....

Protocol

1. تفكك الخلية

1. الحفاظ على خلايا RPE كما هو موضح سابقا^17,22.
   ملاحظة: تزرع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو CO₂ بنسبة 5٪ طوال مدة البروتوكولات.
2. قم بإعداد الكمية المطلوبة من PBS ووسط الثقافة في حمام مائي 37 درجة مئوية وضع كاشف تفكك الخلية في درجة حرارة الغرفة.
3. تخلص من محلول الاستزراع واغسل الأطباق مرتين باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا لكل بئر.
4. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا إلى ألواح 6 آبار وهضم الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، لاحظ الخلايا التي تتقلص وتتألق عند الحواف تحت المجهر لتأكيد إنهاء الهضم.
   ملاح....

النتائج

هنا ، تم تمرير خلايا RPE المشتقة من hESC في P1D35 وبذرها بكثافة 10⁵ / سم². في غضون أسبوع من البذر ، فقدت التشكل السداسي المميز والتصبغ خلال مرحلة التأخر (حوالي 2 أيام). أعادت خلايا RPE تدريجيا اعتماد التشكل السداسي في المرحلة الأسية (حوالي 5 أيام ، الشكل 1 أ) ودخلت مرحلة التبا?.......

Discussion

في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول تجميد ذوبان ناجح لخلايا RPE المشتقة من hESC للبحث والاحتياجات السريرية. على عكس خط خلايا RPE الخالد ، ARPE-19 ، فإن خلايا RPE ذات النمط الظاهري الظهاري المميز المناسب والوظيفة ، مثل الخلايا الجذعية المشتقة من RPE ، أكثر حساسية للحفظ بالتبريد. بقي أقل من 32٪ من الخلايا في.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049