JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا للحفظ بالتبريد الفعال للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية.

Abstract

الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هي مصادر خلايا متفوقة للعلاج باستبدال الخلايا لدى الأفراد المصابين بأمراض تنكسية في شبكية العين. ومع ذلك ، فإن الدراسات حول البنوك المستقرة والآمنة لهذه الخلايا العلاجية نادرة. تعد قابلية بقاء الخلايا المتغيرة للغاية والاسترداد الوظيفي لخلايا RPE بعد الحفظ بالتبريد من أكثر المشكلات شيوعا. في البروتوكول الحالي ، كنا نهدف إلى تحقيق أفضل معدل لاستعادة الخلايا بعد الذوبان عن طريق اختيار مرحلة الخلية المثلى للتجميد بناء على الظروف التجريبية الأصلية. تم تجميد الخلايا في المرحلة الأسية المحددة باستخدام مقايسة وضع العلامات 5-ethynyl-2′-deoxyuridine ، مما أدى إلى تحسين صلاحية الخلية ومعدل الشفاء بعد الذوبان. تم الحصول على خلايا مستقرة ووظيفية بعد فترة وجيزة من ذوبان الجليد ، مستقلة عن عملية تمايز طويلة. تسمح الطرق الموضحة هنا بحفظ وذوبان خلايا RPE المشتقة من hESC بشكل بسيط وفعال وغير مكلف. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على خلايا RPE ، يمكن تطبيق استراتيجية التجميد هذه على العديد من الأنواع الأخرى من الخلايا المتمايزة.

Introduction

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية مصطبغة من الخلايا اللازمة للحفاظ على الوظيفة المناسبة للشبكية1. يرتبط الخلل الوظيفي RPE والوفاة ارتباطا وثيقا بالعديد من الأمراض التنكسية للشبكية ، بما في ذلك التنكس البقعي المرتبط بالعمر والتهاب الشبكية الصباغي ومرض Stargardt 2,3. العلاج ببدائل RPE هو واحد من أكثر أنظمة العلاج الواعدة لهذه الأمراض4،5،6،7. يعد الإمداد المستقر بخلايا RPE المانحة أمرا حيويا للعلاج بالخلايا. تعد خلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) مصدرا مثاليا للخلايا للعلاج بالخلايا لأنها تحاكي وظيفة خلايا RPE الأولية ويمكن أن تنتج إمدادا غير محدود نظريا8. ومع ذلك ، فإن عملية التمايز شاقة والعمر الافتراضي لخلايا RPE التي تم الحصول عليها قصير نسبيا بسبب الانتقال الظهاري الوسيطة اللاحق (EMT). لذلك ، يعد الحفظ بالتبريد لخلايا RPE المشتقة من hESC خطوة لا غنى عنها مطلوبة للتخزين طويل الأجل والتوزيع عند الطلب9.

يمكن أن يؤدي التلف الخلوي الناجم عن الحفظ بالتبريد إلى الإضرار عن غير قصد بالفعالية العلاجية10,11. لذلك ، اقترحت الدراسات الحديثة حول الحفظ بالتبريد أنه يجب تحديد ظروف التخزين المبردة المثلى عند تصميم العلاجات الخلوية12. يضمن الحفظ بالتبريد الناجح استعادة الخلايا بكفاءة ، والقدرة العالية على البقاء ، واستعادة وظيفة الخلية بعد دورة التجميد والذوبان. ومع ذلك ، فقد أبلغت الدراسات السابقة حول الحفظ بالتبريد للطبقات الأحادية الملتصقة لخلايا الثدييات عن معدلات بقاء متغيرة للغاية (35٪ -95٪) بعد ذوبانالجليد 13،14،15. تؤثر العديد من العوامل بشكل كبير على نتائج الحفظ بالتبريد ، خاصة خلال مرحلة التجميد16,17. أظهرت الأبحاث الحديثة أن خلايا RPE المجمدة في نقاط زمنية مختلفة أظهرت تعافيا متنوعا بعد ذوبانالجليد 17. على حد علمنا ، لا توجد دراسات حول تحديد الإطار الزمني الأمثل للتجميد لخلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية. في دراسات مختلفة ، تم تجميد الخلايا في مراحل مختلفة: تم تجميد بعض الخلايا بعد فترة وجيزة من المرور أو قبل التقاء أو تصبغ8،15،18 ، بينما تم تجميد البعض الآخر في نقاط زمنية أخرى9،19،20،21. علاوة على ذلك ، لا يوجد دليل واضح على ما إذا كانت مرحلة أو مرحلة خلايا RPE المستخدمة في الحفظ بالتبريد تؤثر على وظيفة RPE بعد الذوبان. في دراستنا السابقة ، أثبتنا لأول مرة أن المرحلة الأسية لنمو الخلايا (P2D5) هي أفضل مرحلة للحفظ بالتبريد لخلايا RPE المشتقة من hESC من حيث صلاحية الخلية واستعادة الخصائص والوظائف الخلوية17.

تهدف الطريقة التي تم إنشاؤها هنا إلى الحفاظ على RPE المشتق من hESC بالتبريد في المرحلة المثلى لتحقيق أفضل حفظ من حيث صلاحية الخلية ووظيفتها بعد الذوبان. باستخدام مقايسة وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) للكشف عن المرحلة الأسية لتخليق الحمض النووي قبل الحفظ بالتبريد ، أظهرت خلايا RPE المذابة >80٪ من الصلاحية ومعدل التعلق ، والتعبير الجيني الخاص ب RPE ، ومورفولوجيا الخلية المستقطبة ، وإفراز العامل المشتق من ظهارة الصباغ ، والمقاومة المناسبة عبر الظهارة ، والقدرة البلعمية8،17،22. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على خلايا RPE المشتقة من hESC ولا يتم حفظ جميع الخلايا العلاجية بالتبريد على قدم المساواة ، يمكن تطبيق استراتيجية التجميد في المرحلة الأسية على العديد من الخلايا العلاجية الأخرى.

Protocol

1. تفكك الخلية

  1. الحفاظ على خلايا RPE كما هو موضح سابقا17,22.
    ملاحظة: تزرع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪ طوال مدة البروتوكولات.
  2. قم بإعداد الكمية المطلوبة من PBS ووسط الثقافة في حمام مائي 37 درجة مئوية وضع كاشف تفكك الخلية في درجة حرارة الغرفة.
  3. تخلص من محلول الاستزراع واغسل الأطباق مرتين باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا لكل بئر.
  4. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا إلى ألواح 6 آبار وهضم الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، لاحظ الخلايا التي تتقلص وتتألق عند الحواف تحت المجهر لتأكيد إنهاء الهضم.
    ملاحظة: لا ينصح بالتفكك القائم على التربسين لأنه يعطي قابلية منخفضة للخلايا.
  5. ماصة لأعلى ولأسفل بلطف 10x مع ماصة 1 مل لفصل الخلايا ، وتخفيف تعليق الخلية بوسط استزراع مسخن مسبقا (بدون Y-27632) بنسبة 1:10. ثم ، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق في 250 × غرام.
  6. اسكب المادة الطافية بسرعة بعد الطرد المركزي ، وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 2 مل من وسط الثقافة ، وأعد تعليق الخلايا 10-15x باستخدام ماصة.
  7. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على تعليق أحادي الخلية وحساب عدد الخلايا.
    ملاحظة: يعد التعليق أحادي الخلية ضروريا لعد الخلايا بدقة وكثافة بذر الخلايا الموحدة بعد الذوبان.

2. تحديد مرحلة الخلية المثلى للحفظ بالتبريد

ملاحظة: نظرا لأن حالة الخلية تختلف بين طرق التمايز وخطوط الخلايا ، يجب تحديد المرحلة الأسية لخلايا RPE المزروعة في مختبرات مختلفة قبل التجميد.

  1. قم بإذابة قارورة واحدة من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد عند 4 درجات مئوية طوال الليل. خفف المصفوفة إلى 12 مل من DMEM / F-12 البارد واخلطها جيدا. أضف غطاء واحد لكل بئر ، وقم بتغطية كل بئر من صفيحة 24 بئرا ب 0.25 مل من المحلول المخفف. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام ونضح محلول الطلاء قبل طلاء الخلايا مباشرة.
    ملاحظة: تعليمات حجم القسمة خاصة بالكمية بناء على تركيز البروتين وتوجد في ورقة مواصفات المنتج.
  2. قم بزرع الخلايا المفردة RPE من الخطوة 1.7 على أغطية مغطاة بمصفوفة الغشاء القاعدي بكثافة 105 / سم2 في 1 مل من وسط الاستزراع. قم بتحديث وسط الثقافة كل 2-3 أيام.
  3. في النقاط الزمنية المحددة (1 و 3 و 5 و 7 و 11 يوما بعد المرور) ، احتضان خلايا RPE مع 10 μM EdU في الوسط لمدة 24 ساعة. قم بإصلاح الخلايا واختراقها وتلطيخها باستخدام كوكتيل التفاعل كما هو موضح في الدليل للكشف عن EdU المدمج.
  4. التقط صورا من خمسة حقول عشوائية تحت مجهر مضان واحسب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل EdU. ارسم منحنيات EdU الموجبة للوقت المقابل لإنشاء منحنى نمو. ثم حدد نافذة التجميد أو المرحلة الأسية لكل خط خلية وفقا لمنحنى النمو.
    ملاحظة: يشير مورفولوجيا الخلايا السداسية المعاد تأسيسها إلى أن الخلايا تخرج من المرحلة الأسية.

3. الحفظ بالتبريد

  1. باتباع الخطوات من 1.1 إلى 1.7 ، باستثناء أن وقت الهضم ينخفض إلى 5 دقائق ، قم بطرد مركزي تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق عند 250 × جم.
  2. تخلص من المادة الطافية عن طريق سكبها بسرعة بعد الطرد المركزي وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في وسط الحفظ بالتبريد إلى كثافة 2 × 106 خلايا / مل ونقل 1 مل من معلق الخلية إلى 1.2 مل قوارير مبردة.
  3. ضع القوارير المبردة على الفور في وعاء تجميد ، وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية طوال الليل لتحقيق معدل تبريد -1 درجة مئوية / دقيقة ، ثم انقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

4. ذوبان الجليد

  1. قم بتسخين وسط الاستزراع في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واملأ 10 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا في أنبوب سعة 15 مل.
  2. قم بإذابة القوارير المبردة بسرعة مأخوذة مباشرة من تخزين النيتروجين السائل باستخدام نظام إذابة آلي.
  3. قم بتقطير 0.5-1 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا في القارورة المبردة لضمان تكيف الخلايا المجمدة تدريجيا مع البيئة الجديدة. بعد ذلك ، قم بنقل 1.5-2 مل من معلق الخلية إلى 10 مل من وسط الاستزراع في أنبوب سعة 15 مل وطرد مركزي للخلايا عند 250 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخلص من المادة الطافية عن طريق سكبها بسرعة بعد الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا ، واحسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم لتحديد معدلات الاسترداد والبقاء على قيد الحياة باستخدام استبعاد أزرق تريبان القياسي (0.4٪ صبغة تريبان الزرقاء).
  5. استزراع الخلايا على الأسطح المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي بكثافة 105 خلايا قابلة للحياة / سم2 في وسط استزراع مكمل ب Y-27632 (التركيز النهائي: 10 ميكرومتر). قم بإزالة Y-27632 بعد 24 ساعة.
  6. لتحديد معدل التعلق ، افصل الخلايا مرة أخرى واحسب عدد الخلايا بعد 24 ساعة من الذوبان.

5. التحقق من صحة مرحلة التجميد المثلى

  1. للتحقق من صحة مرحلة التجميد المثلى المحددة في الخطوة 2.4 ، قم بإذابة خلايا RPE المجمدة في نقاط زمنية وثقافة مختلفة لمدة 28 يوما. حصاد الخلايا ل qPCR وتحليل المناعة لتقييم التعبير عن علامات RPE كما هو موضح سابقا17.

النتائج

هنا ، تم تمرير خلايا RPE المشتقة من hESC في P1D35 وبذرها بكثافة 105 / سم2. في غضون أسبوع من البذر ، فقدت التشكل السداسي المميز والتصبغ خلال مرحلة التأخر (حوالي 2 أيام). أعادت خلايا RPE تدريجيا اعتماد التشكل السداسي في المرحلة الأسية (حوالي 5 أيام ، الشكل 1 أ) ودخلت مرحلة التبا?...

Discussion

في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول تجميد ذوبان ناجح لخلايا RPE المشتقة من hESC للبحث والاحتياجات السريرية. على عكس خط خلايا RPE الخالد ، ARPE-19 ، فإن خلايا RPE ذات النمط الظاهري الظهاري المميز المناسب والوظيفة ، مثل الخلايا الجذعية المشتقة من RPE ، أكثر حساسية للحفظ بالتبريد. بقي أقل من 32٪ من الخلايا في...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970816) إلى مي جيانغ. المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82201223) إلى Xinyue Zhu ؛ وخطة عمل الابتكار العلمي والتكنولوجي للجنة شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (2014090067000) إلى Haiyun Liu.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40 μm Cell strainerCorning431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 DyeThermo Fisher ScientificC10337
Cryo freezing containerNalgene5100-0001
CryoStor CS10Biolife Solutions07930cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
GenxinSelcellYB050050cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cellsprovided by Wicell, USAH9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified MatrixCorning354277basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing SystemBioLife SolutionsAST-601
Trypan Blue solution 0.4%SigmaT8154
TryPLE SelectThermo Fisher Scientific12563029cell dissociation reagent
XVIVO-10 mediumLonzaBEBP04-743QRPE culture medium
Y-27632SelleckS1049

References

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease. American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).
  3. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  4. Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration. Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).
  5. Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).
  6. Da Cruz, ., L, , et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  7. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  8. Buchholz, D. E., et al. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).
  9. Li, Q. -. Y., et al. Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases. Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).
  10. Francois, M., et al. Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing. Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).
  11. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties. Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).
  12. Ekpo, M. D., et al. Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper. Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).
  13. Bailey, T. L., et al. Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells. Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).
  14. Okumura, N., et al. Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells. PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).
  15. Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).
  16. Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use. Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).
  17. Zhang, T., et al. Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454 (2022).
  18. Leach, L. L., et al. Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).
  19. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  20. Brandl, C., et al. In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).
  21. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291 (2017).
  22. Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).
  23. Marcantonini, G., et al. Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin. Molecules. 27 (10), 3254 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

5 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved