Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Resumo

Este estudo fornece um protocolo detalhado para a criopreservação eficiente de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas.

Resumo

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são fontes celulares superiores para terapia de reposição celular em indivíduos com doenças degenerativas da retina; no entanto, estudos sobre o armazenamento estável e seguro dessas células terapêuticas são escassos. A viabilidade celular altamente variável e a recuperação funcional das células RPE após a criopreservação são os problemas mais comumente encontrados. No presente protocolo, nosso objetivo foi alcançar a melhor taxa de recuperação celular após o descongelamento, selecionando a fase celular ideal para congelamento com base nas condições experimentais originais. As células foram congeladas na fase exponencial determinada usando o ensaio de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina, que melhorou a viabilidade celular e a taxa de recuperação após o descongelamento. Células estáveis e funcionais foram obtidas logo após o descongelamento, independentemente de um longo processo de diferenciação. Os métodos descritos aqui permitem a preservação e descongelamento simples, eficientes e baratos de células RPE derivadas de hESC. Embora este protocolo se concentre em células RPE, essa estratégia de congelamento pode ser aplicada a muitos outros tipos de células diferenciadas.

Introdução

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada pigmentada de células necessárias para manter o funcionamento adequado da retina¹. A disfunção e a morte do EPR estão intimamente associadas a muitas doenças degenerativas da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e doença de Stargardt ^2,3. A terapia de reposição do EPR é um dos esquemas de tratamento mais promissores para essas doenças 4,5,6,7. Um suprimento estável de células RPE do doador é vital para a terapia celular. As células RPE derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESC) são uma fonte celular ideal para terapia celular porque imitam a função das células primárias de RPE e podem produzir um suprimento teoricamente ilimitado⁸. No entanto, o processo de diferenciação é trabalhoso e a vida útil das células RPE obtidas é relativamente curta devido à subsequente transição epitelial-mesenquimal (EMT). Portanto, a criopreservação de células RPE derivadas de hESC é uma etapa indispensável necessária para armazenamento de longo prazo e distribuição sob demanda⁹.

O dano celular induzido pela criopreservação pode comprometer inadvertidamente a eficácia terapêutica^10,11. Portanto, estudos recentes sobre criopreservação propuseram que as condições ideais de armazenamento criogênico devem ser determinadas ao projetar terapias celulares¹². A criopreservação bem-sucedida garante recuperação celular eficiente, alta viabilidade e restauração da função celular após o ciclo de congelamento e descongelamento. No entanto, estudos anteriores sobre a criopreservação das monocamadas aderentes de células de mamíferos relataram taxas de sobrevivência altamente variáveis (35%-95%) após o descongelamento 13,14,15. Muitos fatores afetam consideravelmente os resultados da criopreservação, particularmente durante o estágio de congelamento^16,17. Pesquisas recentes mostraram que as células RPE congeladas em diferentes momentos exibiram recuperação variada após o descongelamento¹⁷. Até onde sabemos, faltam estudos sobre a determinação da janela de tempo de congelamento ideal para células-tronco derivadas de células-tronco. Em diferentes estudos, as células foram congeladas em vários estágios: algumas células foram congeladas logo após a passagem ou antes da confluência ou pigmentação ^8,15,18, enquanto outras foram congeladas em outros momentos ^9,19,20,21. Além disso, não há evidências claras de se a fase ou estágio das células RPE usadas para criopreservação afeta a função do RPE após o descongelamento. Em nosso estudo anterior, demonstramos pela primeira vez que a fase exponencial do crescimento celular (P2D5) é o melhor estágio para a criopreservação de células RPE derivadas de hESC em termos de viabilidade celular e recuperação de propriedades e funções celulares¹⁷.

O método aqui estabelecido visa criopreservar o RPE derivado de hESC em um estágio ideal para obter a melhor preservação em termos de viabilidade e função celular após o descongelamento. Usando o ensaio de marcação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para detectar a fase exponencial da síntese de DNA antes da criopreservação, as células RPE descongeladas exibiram viabilidade e taxa de fixação >80%, expressão gênica específica de RPE, morfologia celular polarizada, secreção de fator derivado do epitélio pigmentar, resistência transepitelial apropriada e capacidade fagocítica ^8,17,22. Embora este protocolo se concentre em células RPE derivadas de hESC e nem todas as células terapêuticas sejam igualmente criopreservadas, a estratégia de congelamento na fase exponencial pode ser aplicada a muitas outras células terapêuticas.

Protocolo

1. Dissociação celular

1. Manter as células EPR conforme descrito anteriormente ^17,22.
   NOTA: Todas as células são cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO₂ durante toda a duração dos protocolos.
2. Prepare a quantidade necessária de PBS e meio de cultura em banho-maria a 37 ° C e coloque o reagente de dissociação celular em temperatura ambiente.
3. Descarte a solução de cultura e lave as placas duas vezes com 1 mL de PBS pré-aquecido por poço.
4. Adicione 1 ml do reagente de dissociação celular às placas de 6 poços e digerir as células a 37 °C durante 15 min. Após a incubação, observe as células que encolhem e brilham nas bordas sob um microscópio para confirmar o término da digestão.
   NOTA: A dissociação à base de tripsina não é recomendada, pois proporciona baixa viabilidade celular.
5. Pipete para cima e para baixo suavemente 10x com uma pipeta de 1 mL para dissociar as células e dilua a suspensão celular com meio de cultura pré-aquecido (sem Y-27632) na proporção de 1:10. Em seguida, centrifugue as células à temperatura ambiente por 3 min a 250 × g.
6. Despeje rapidamente o sobrenadante após a centrifugação, ressuspenda suavemente o pellet celular em 2 mL do meio de cultura e ressuspenda as células 10-15x com uma pipeta.
7. Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 40 μm para obter uma suspensão unicelular e calcular o número de células.
   NOTA: Uma suspensão unicelular é essencial para uma contagem precisa de células e densidade de semeadura celular uniforme após o descongelamento.

2. Determinação do estágio celular ideal para criopreservação

NOTA: Como o estado celular varia entre os métodos de diferenciação e as linhagens celulares, a fase exponencial das células RPE cultivadas em diferentes laboratórios deve ser determinada antes do congelamento.

1. Descongelar um frasco para injetáveis de solução de matriz de membrana basal em gelo a 4 °C durante a noite. Dilua a matriz em 12 mL de DMEM/F-12 frio e misture bem. Adicione uma lamínula por alvéolo e cubra cada poço de uma placa de 24 poços com 0,25 mL da solução diluída. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C antes de utilizar e aspirar a solução de revestimento imediatamente antes de plaquear as células.
   NOTA: As instruções para o volume da alíquota são específicas do lote com base na concentração de proteína e são encontradas na folha de especificações do produto.
2. Semeie as células únicas do EPR da etapa 1.7 nas lamínulas revestidas com matriz da membrana basal a uma densidade de 10⁵ / cm² em 1 mL de meio de cultura. Atualize o meio de cultura a cada 2-3 dias.
3. Nos pontos de tempo indicados (1, 3, 5, 7 e 11 dias após a passagem), incube células RPE com 10 μM EdU no meio por 24 h. Fixe, permeabilize e core as células com o coquetel de reação conforme descrito no manual para detectar EdU incorporada.
4. Capture imagens de cinco campos aleatórios sob um microscópio de fluorescência e calcule a porcentagem de células EdU-positivas. Plote as curvas de proporção-tempo positivas para EdU correspondentes para gerar uma curva de crescimento. Em seguida, determine a janela de congelamento ou a fase exponencial para cada linha celular de acordo com a curva de crescimento.
   NOTA: A morfologia celular hexagonal restabelecida indica que as células saem da fase exponencial.

3. Criopreservação

1. Seguindo os passos 1.1 a 1.7, exceto que o tempo de digestão diminui para 5 min, centrifugue a suspensão celular à temperatura ambiente por 3 min a 250 × g.
2. Descarte o sobrenadante despejando rapidamente após a centrifugação e ressuspenda suavemente o pellet celular no meio de criopreservação a uma densidade de 2 × 10⁶ células / mL e transfira 1 mL da suspensão celular para frascos criogênicos de 1,2 mL.
3. Coloque imediatamente os frascos criogênicos em um recipiente de congelamento, congele a -80 ° C durante a noite para atingir uma taxa de resfriamento de -1 ° C / min e, em seguida, transfira os frascos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

4. Descongelamento

1. Aquecer o meio de cultura num banho-maria a 37 °C e encher previamente 10 ml de meio de cultura pré-aquecido num tubo de 15 ml.
2. Descongele rapidamente os frascos criogênicos retirados diretamente do armazenamento de nitrogênio líquido usando um sistema de descongelamento automatizado.
3. Goteje 0,5-1 mL de meio de cultura pré-aquecido no frasco criogênico para garantir que as células congeladas se adaptem gradualmente ao novo ambiente. Em seguida, transfira 1,5-2 mL da suspensão celular para 10 mL do meio de cultura em um tubo de 15 mL e centrifugue as células a 250 × g por 3 min em temperatura ambiente.
4. Descarte o sobrenadante despejando rapidamente após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 2 mL de meio de cultura pré-aquecido e conte o número de células usando um hemocitômetro para determinar as taxas de recuperação e sobrevivência usando a exclusão padrão de azul de tripano (0,4% de coloração azul de tripano).
5. Cultivar as células em superfícies revestidas com matriz da membrana basal a uma densidade de 10⁵ células viáveis / cm² em um meio de cultura suplementado com Y-27632 (concentração final: 10 μM). Remova o Y-27632 após 24 h.
6. Para determinar a taxa de fixação, dissocie as células novamente e conte o número de células 24 h após o descongelamento.

5. Validação da fase de congelação ideal

1. Para validar a fase de congelamento ideal determinada na etapa 2.4, descongele as células RPE congeladas em diferentes pontos de tempo e cultura por 28 dias. Colher as células para qPCR e análise de imunocoloração para avaliar a expressão de marcadores de EPR, conforme descrito anteriormente¹⁷.

Resultados

Aqui, células RPE derivadas de hESC em P1D35 foram passadas e semeadas a uma densidade de 10⁵ / cm². Dentro de uma semana após a semeadura, a morfologia hexagonal característica e a pigmentação foram perdidas durante a fase de latência (aproximadamente 2 dias). As células RPE gradualmente readotaram a morfologia hexagonal na fase exponencial (aproximadamente 5 dias, Figura 1A) e entraram na fase de desaceleração (aproximadamente 6 dias) com uma morfologia mais ...

Discussão

No presente estudo, é descrito um protocolo de congelamento e descongelamento bem-sucedido para células RPE derivadas de hESC para pesquisa e necessidades clínicas. Ao contrário da linhagem celular RPE imortalizada, ARPE-19, as células RPE com fenótipo epitelial e função característicos adequados, como as células RPE derivadas de células-tronco, são mais sensíveis à criopreservação. Menos de 32% das células permaneceram 24 h após o descongelamento, se não forem adequadamente preservadas

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049