Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Zusammenfassung

Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die effiziente Kryokonservierung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen.

Zusammenfassung

Retinale Pigmentepithelzellen (RPE), die aus humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind überlegene Zellquellen für die Zellersatztherapie bei Personen mit degenerativen Netzhauterkrankungen. Studien über die stabile und sichere Lagerung dieser therapeutischen Zellen gibt es jedoch kaum. Die hochvariable Zellviabilität und die funktionelle Wiederherstellung von RPE-Zellen nach der Kryokonservierung sind die am häufigsten auftretenden Probleme. Im vorliegenden Protokoll haben wir versucht, die beste Zellwiederherstellungsrate nach dem Auftauen zu erreichen, indem wir die optimale Zellphase für das Einfrieren auf der Grundlage der ursprünglichen experimentellen Bedingungen ausgewählt haben. Die Zellen wurden in der exponentiellen Phase eingefroren, die mit dem 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin-Markierungsassay bestimmt wurde, was die Lebensfähigkeit der Zellen und die Wiederfindungsrate nach dem Auftauen verbesserte. Kurz nach dem Auftauen wurden stabile und funktionsfähige Zellen erhalten, unabhängig von einem langen Differenzierungsprozess. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die einfache, effiziente und kostengünstige Konservierung und das Auftauen von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen. Obwohl sich dieses Protokoll auf RPE-Zellen konzentriert, kann diese Einfrierstrategie auf viele andere Arten von differenzierten Zellen angewendet werden.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine pigmentierte Monoschicht von Zellen, die für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Funktion der Netzhaut erforderlich ist¹. RPE-Dysfunktion und Tod sind eng mit vielen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut verbunden, darunter altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa und Morbus Stargardt ^2,3. Die RPE-Ersatztherapie ist eines der vielversprechendsten Behandlungsschemata für diese Erkrankungen 4,5,6,7. Eine stabile Versorgung mit RPE-Spenderzellen ist für die Zelltherapie unerlässlich. Aus humanen embryonalen Stammzellen (hESC) gewonnene RPE-Zellen sind eine ideale Zellquelle für die Zelltherapie, da sie die Funktion primärer RPE-Zellen nachahmen und einen theoretisch unbegrenzten Vorrat produzieren können⁸. Der Differenzierungsprozess ist jedoch mühsam und die Haltbarkeit der gewonnenen RPE-Zellen ist aufgrund der anschließenden epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) relativ kurz. Daher ist die Kryokonservierung von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen ein unverzichtbarer Schritt, der für die Langzeitlagerung und die bedarfsgerechte Verteilung erforderlich^{ist 9}.

Durch Kryokonservierung induzierte zelluläre Schäden können die therapeutische Wirksamkeit ungewollt beeinträchtigen ^10,11. Neuere Studien zur Kryokonservierung haben daher vorgeschlagen, dass bei der Entwicklung von Zelltherapien optimale kryogene Lagerbedingungen bestimmt werden sollten¹². Eine erfolgreiche Kryokonservierung garantiert eine effiziente Zellrückgewinnung, eine hohe Lebensfähigkeit und die Wiederherstellung der Zellfunktion nach dem Frost-Auftau-Zyklus. Frühere Studien zur Kryokonservierung der adhärenten Monoschichten von Säugetierzellen haben jedoch sehr unterschiedliche (35%-95%) Überlebensraten nach dem Auftauen berichtet 13,14,15. Viele Faktoren beeinflussen die Ergebnisse der Kryokonservierung erheblich, insbesondere während der Gefrierphase^16,17. Neuere Forschungen zeigten, dass RPE-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten eingefroren wurden, nach dem Auftauen eine unterschiedliche Erholung^{zeigten 17}. Nach bestem Wissen und Gewissen fehlen Studien zur Bestimmung des optimalen Gefrierzeitfensters für stammzellgewonnene RPE-Zellen. In verschiedenen Studien wurden die Zellen in verschiedenen Stadien eingefroren: Einige Zellen wurden kurz nach der Passage oder vor der Konfluenz oder Pigmentierung^{eingefroren 8,15,18}, während andere zu anderen Zeitpunkten^{eingefroren wurden} 9,19,20,21. Darüber hinaus gibt es keine eindeutigen Hinweise darauf, ob die Phase oder das Stadium von RPE-Zellen, die für die Kryokonservierung verwendet werden, die RPE-Funktion nach dem Auftauen beeinflusst. In unserer vorherigen Studie haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass die exponentielle Phase des Zellwachstums (P2D5) das beste Stadium für die Kryokonservierung von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen im Hinblick auf die Zellviabilität und die Wiederherstellung zellulärer Eigenschaften und Funktionen ist¹⁷.

Die hier etablierte Methode zielt darauf ab, hESC-abgeleitetes RPE in einem optimalen Stadium zu kryokonservieren, um die beste Konservierung in Bezug auf die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen nach dem Auftauen zu erreichen. Unter Verwendung des 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridins (EdU)-Markierungsassays zum Nachweis der exponentiellen Phase der DNA-Synthese vor der Kryokonservierung zeigten aufgetaute RPE-Zellen eine >80%ige Lebensfähigkeit und Anheftungsrate, eine RPE-spezifische Genexpression, eine polarisierte Zellmorphologie, eine Sekretion von Pigmentepithelfaktoren, eine angemessene transepitheliale Resistenz und phagozytische Fähigkeit ^8,17,22. Obwohl sich dieses Protokoll auf hESC-abgeleitete RPE-Zellen konzentriert und nicht alle therapeutischen Zellen gleichermaßen kryokonserviert sind, kann die Strategie des Einfrierens in der exponentiellen Phase auf viele andere therapeutische Zellen angewendet werden.

Protokoll

1. Dissoziation der Zellen

1. Pflegen Sie die RPE-Zellen wie zuvor beschrieben^17,22.
   HINWEIS: Alle Zellen werden während der gesamten Dauer der Protokolle bei 37 °C in einer 5 % CO₂ -Atmosphäre gezüchtet.
2. Bereiten Sie die erforderliche Menge PBS und Kulturmedium in einem 37 ° C warmen Wasserbad vor und stellen Sie das Zelldissoziationsreagenz auf Raumtemperatur.
3. Entsorgen Sie die Kulturlösung und waschen Sie die Platten zweimal mit 1 ml vorgewärmtem PBS pro Vertiefung.
4. Geben Sie 1 ml des Zelldissoziationsreagenzes in die 6-Well-Platten und verdauen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 °C. Beobachten Sie nach der Inkubation die Zellen, die schrumpfen und an den Rändern glänzen, unter einem Mikroskop, um die Beendigung der Verdauung zu bestätigen.
   HINWEIS: Eine Dissoziation auf Trypsinbasis wird nicht empfohlen, da sie eine geringe Zellviabilität aufweist.
5. Pipettieren Sie vorsichtig 10x mit einer 1-ml-Pipette auf und ab, um die Zellen zu dissoziieren, und verdünnen Sie die Zellsuspension mit vorgewärmtem Kulturmedium (ohne Y-27632) im Verhältnis 1:10. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 3 min bei 250 × g.
6. Gießen Sie den Überstand nach der Zentrifugation schnell aus, resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2 mL des Kulturmediums und resuspendieren Sie die Zellen 10-15x mit einer Pipette.
7. Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 40 μm Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen.
   HINWEIS: Eine einzelzellige Suspension ist für eine genaue Zellzählung und eine gleichmäßige Zellaussaatdichte nach dem Auftauen unerlässlich.

2. Bestimmung des optimalen Zellstadiums für die Kryokonservierung

HINWEIS: Da der Zellzustand zwischen Differenzierungsmethoden und Zelllinien variiert, sollte die exponentielle Phase von RPE-Zellen, die in verschiedenen Labors kultiviert wurden, vor dem Einfrieren bestimmt werden.

1. Tauen Sie ein Fläschchen mit Basalmembran-Matrix-Lösung über Nacht bei 4 °C auf Eis auf. Die Matrix in 12 mL kaltes DMEM/F-12 verdünnen und gut mischen. Fügen Sie ein Deckglas pro Vertiefung hinzu und beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 0,25 ml der verdünnten Lösung. Die Platte vor Gebrauch 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren und die Beschichtungslösung kurz vor dem Plattieren der Zellen absaugen.
   HINWEIS: Die Anweisungen für das aliquote Volumen sind chargenspezifisch basierend auf der Proteinkonzentration und finden Sie im Produktdatenblatt.
2. Die RPE-Einzelzellen aus Schritt 1.7 werden auf die mit Basalmembranmatrix beschichteten Deckgläser mit einer Dichte von 10⁵/cm² in 1 mL Kulturmedium ausgeimpft. Frischen Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage auf.
3. Zu den angegebenen Zeitpunkten (1, 3, 5, 7 und 11 Tage nach der Passage) inkubieren Sie RPE-Zellen mit 10 μM EdU im Medium für 24 Stunden. Fixieren, permeabilisieren und färben Sie die Zellen mit dem Reaktionscocktail, wie im Handbuch zum Nachweis von eingebautem EdU beschrieben.
4. Nehmen Sie Bilder von fünf zufälligen Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop auf und berechnen Sie den Prozentsatz der EdU-positiven Zellen. Zeichnen Sie die entsprechenden EdU-positiven Verhältnis-Zeit-Kurven, um eine Wachstumskurve zu erstellen. Bestimmen Sie dann das Gefrierfenster oder die Exponentialphase für jede Zelllinie gemäß der Wachstumskurve.
   HINWEIS: Die wiederhergestellte hexagonale Zellmorphologie deutet darauf hin, dass die Zellen die exponentielle Phase verlassen.

3. Kryokonservierung

1. Nach den Schritten 1.1 bis 1.7 wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur 3 Minuten lang bei 250 × g zentrifugiert, mit der Ausnahme, dass sich die Aufschlusszeit auf 5 Minuten verringert.
2. Entsorgen Sie den Überstand durch schnelles Eingießen nach der Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig im Kryokonservierungsmedium auf eine Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml und überführen Sie 1 ml der Zellsuspension in 1,2 mL Kryofläschchen.
3. Stellen Sie die kryogenen Fläschchen sofort in einen Gefrierbehälter, frieren Sie sie über Nacht bei -80 °C ein, um eine Abkühlrate von -1 °C/min zu erreichen, und überführen Sie die Fläschchen dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.

4. Auftauen

1. Erwärmen Sie das Kulturmedium in einem 37 °C warmen Wasserbad und füllen Sie 10 mL vorgewärmtes Kulturmedium in ein 15 mL Röhrchen vor.
2. Tauen Sie die kryogenen Fläschchen, die direkt aus dem Flüssigstickstofflager entnommen werden, mit einem automatischen Auftausystem schnell auf.
3. Tropfen Sie 0,5-1 ml vorgewärmtes Kulturmedium in das kryogene Fläschchen, um sicherzustellen, dass sich die gefrorenen Zellen allmählich an die neue Umgebung anpassen. Übertragen Sie dann 1,5-2 mL der Zellsuspension auf 10 mL des Kulturmediums in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Verwerfen Sie den Überstand durch schnelles Eingießen nach der Zentrifugation, resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml vorgewärmtem Kulturmedium und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer, um die Wiederfindungs- und Überlebensraten unter Verwendung des Standard-Trypanblau-Ausschlusses (0,4 % Trypanblau-Fleck) zu bestimmen.
5. Die Zellen werden auf mit Basalmembranmatrix beschichteten Oberflächen mit einer Dichte von 10⁵ lebensfähigen Zellen/^cm2 in einem mit Y-27632 (Endkonzentration: 10 μM) angereicherten Kulturmedium kultiviert. Entfernen Sie Y-27632 nach 24 h.
6. Um die Anheftungsrate zu bestimmen, dissoziieren Sie die Zellen erneut und zählen Sie die Anzahl der Zellen 24 h nach dem Auftauen.

5. Validierung der optimalen Gefrierphase

1. Um die in Schritt 2.4 ermittelte optimale Gefrierphase zu validieren, tauen Sie RPE-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten eingefroren wurden, auf und kulturieren Sie sie 28 Tage lang. Ernte der Zellen für qPCR- und Immunfärbeanalysen, um die Expression von RPE-Markern wie zuvor beschrieben zu bewerten¹⁷.

Ergebnisse

Hier wurden hESC-abgeleitete RPE-Zellen an P1D35 mit einer Dichte von 10⁵/^cm2 passageiert und ausgesiedelt. Innerhalb einer Woche nach der Aussaat gingen die charakteristische hexagonale Morphologie und Pigmentierung während der Verzögerungsphase (ca. 2 Tage) verloren. RPE-Zellen nahmen in der exponentiellen Phase (ca. 5 Tage, Abbildung 1A) allmählich die hexagonale Morphologie wieder an und traten mit einer polygonaleren Morphologie in die Verlangsamungsphase (ca. 6...

Diskussion

In der vorliegenden Studie wird ein erfolgreiches Freeze-Tau-Protokoll für hESC-abgeleitete RPE-Zellen für Forschung und klinische Zwecke beschrieben. Im Gegensatz zur immortalisierten RPE-Zelllinie ARPE-19 sind RPE-Zellen mit dem richtigen charakteristischen epithelialen Phänotyp und der richtigen Funktion, wie z. B. aus Stammzellen gewonnene RPE-Zellen, empfindlicher gegenüber der Kryokonservierung. Weniger als 32 % der Zellen blieben 24 Stunden nach dem Auftauen erhalten, wenn sie nicht richtig konserviert

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049