Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Zusammenfassung

Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die effiziente Kryokonservierung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen.

Zusammenfassung

Retinale Pigmentepithelzellen (RPE), die aus humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind überlegene Zellquellen für die Zellersatztherapie bei Personen mit degenerativen Netzhauterkrankungen. Studien über die stabile und sichere Lagerung dieser therapeutischen Zellen gibt es jedoch kaum. Die hochvariable Zellviabilität und die funktionelle Wiederherstellung von RPE-Zellen nach der Kryokonservierung sind die am häufigsten auftretenden Probleme. Im vorliegenden Protokoll haben wir versucht, die beste Zellwiederherstellungsrate nach dem Auftauen zu erreichen, indem wir die optimale Zellphase für das Einfrieren auf der Grundlage der ursprünglichen experimentellen Bedingungen ausgewählt haben. Die Zellen wurden in der exponentiellen Phase eingefroren, die mit dem 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin-Markierungsassay bestimmt wurde, was die Lebensfähigkeit der Zellen und die Wiederfindungsrate nach dem Auftauen verbesserte. Kurz nach dem Auftauen wurden stabile und funktionsfähige Zellen erhalten, unabhängig von einem langen Differenzierungsprozess. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die einfache, effiziente und kostengünstige Konservierung und das Auftauen von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen. Obwohl sich dieses Protokoll auf RPE-Zellen konzentriert, kann diese Einfrierstrategie auf viele andere Arten von differenzierten Zellen angewendet werden.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine pigmentierte Monoschicht von Zellen, die für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Funktion der Netzhaut erforderlich ist¹. RPE-Dysfunktion und Tod sind eng mit vielen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut verbunden, darunter altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa und Morbus Stargardt ^2,3. Die RPE-Ersatztherapie ist eines der vielversprechendsten Behandlungsschemata für diese Erkrankungen 4,5,6,7.

Protokoll

1. Dissoziation der Zellen

1. Pflegen Sie die RPE-Zellen wie zuvor beschrieben^17,22.
   HINWEIS: Alle Zellen werden während der gesamten Dauer der Protokolle bei 37 °C in einer 5 % CO₂ -Atmosphäre gezüchtet.
2. Bereiten Sie die erforderliche Menge PBS und Kulturmedium in einem 37 ° C warmen Wasserbad vor und stellen Sie das Zelldissoziationsreagenz auf Raumtemperatur.
3. Entsorgen Sie die Kulturlösung und waschen Sie die Platten zweimal mit 1 ml vorgewärmtem PBS pro Vertiefung.
4. Geben Sie 1 ml des Zelldissoziationsreagenzes in die 6-Well-Platten und ver....

Diskussion

In der vorliegenden Studie wird ein erfolgreiches Freeze-Tau-Protokoll für hESC-abgeleitete RPE-Zellen für Forschung und klinische Zwecke beschrieben. Im Gegensatz zur immortalisierten RPE-Zelllinie ARPE-19 sind RPE-Zellen mit dem richtigen charakteristischen epithelialen Phänotyp und der richtigen Funktion, wie z. B. aus Stammzellen gewonnene RPE-Zellen, empfindlicher gegenüber der Kryokonservierung. Weniger als 32 % der Zellen blieben 24 Stunden nach dem Auftauen erhalten, wenn sie nicht richtig konserviert

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049