ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

要約

この研究は、ヒト幹細胞由来の網膜色素上皮細胞の効率的な凍結保存のための詳細なプロトコルを提供します。

要約

ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来する網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性疾患の個人における細胞補充療法のための優れた細胞源です。しかし、これらの治療細胞の安定的かつ安全なバンキングに関する研究は少ないです。凍結保存後のRPE細胞の非常に変動する細胞生存率と機能回復は、最も一般的に遭遇する問題です。本プロトコールでは、元の実験条件に基づいて凍結に最適な細胞相を選択することで、解凍後の細胞回収率を最高にすることを目指しました。細胞は、5-エチニル-2′-デオキシウリジン標識アッセイを使用して決定された指数関数的段階で凍結され、融解後の細胞生存率と回収率が向上しました。融解後まもなく、長い分化プロセスとは無関係に、安定で機能的な細胞が得られました。ここで説明する方法により、hESC由来RPE細胞の保存と融解を簡便、効率的、かつ安価に行うことができます。このプロトコルはRPE細胞に焦点を当てていますが、この凍結戦略は他の多くの種類の分化細胞に適用することができます。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、網膜¹の適切な機能を維持するために必要な細胞の色素性単層である。RPEの機能不全と死は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、シュタルガルト病など、多くの網膜変性疾患と密接に関連しています^2,3。RPE補充療法は、これらの疾患に対する最も有望な治療レジメンの1つです4,5,6,7。細胞治療には、ドナーRPE細胞の安定供給が不可欠です。ヒト胚性幹細胞(hESC)由来のRPE細胞は、初代RPE細胞の機能を模倣し、理論的には無制限の供給を生産できるため、細胞治療に理想的な細胞源です⁸。しかし、分化プロセスは面倒であり、得られたRPE細胞の貯蔵寿命は、その後の上皮間葉転換(EMT)のために比較的短いです。したがって、hESC由来RPE細胞の凍結保存は、長期保存および^{オンデマンド配布9}に必要な必須ステップである。

凍結保存による細胞損傷は、治療効果を不注....

プロトコル

1. 細胞の解離

1. RPE細胞は、前述した^17,22と同様に維持する。
   注:すべての細胞は、プロトコルの期間中、5%_CO2 雰囲気中で37°Cで増殖します。
2. 37°Cの水浴で必要量のPBSと培地を調製し、細胞解離試薬を室温で置く。
3. 培養液を廃棄し、ウェルあたり1 mLの予熱したPBSでプレートを2回洗浄します。
4. 1 mLの細胞解離試薬を6ウェルプレートに加え、細胞を37°Cで15分間消化します。インキュベーション後、縮小して端部が光る細胞を顕微鏡で観察し、消化の終了を確認します。
   注:トリプシンベースの解離は、細胞生存率が低いため、推奨されません。
5. 1 mLピペットで10回静かにピペットを上下させて細胞を解離し、細胞懸濁液を予熱した培地(Y-27632なし)で1:10の比率で希釈します。次に、細胞を室温で250 × gで3分間遠心分離します。
6. 遠心分離後、上清を迅速に注ぎ出し、細胞ペレットを2mLの培養培地に穏やかに再懸濁し、ピペットで細胞を10〜15倍再懸濁します。
7. 40 μmのセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過してシングルセル懸濁液を取得し、細胞数を計算します。
   注:シングルセル懸濁液....

ディスカッション

本研究では、研究および臨床ニーズに対するhESC由来RPE細胞の成功した凍結融解プロトコルについて説明します。不死化RPE細胞株ARPE-19とは異なり、幹細胞由来のRPE細胞のように、適切な特性の上皮表現型と機能を持つRPE細胞は、凍結保存に対してより敏感です。適切に保存されていない場合、融解後24時間で残った細胞は32%未満でした¹⁷。凍結保存のタイミングは重要なパラ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049