ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

要約

この研究は、ヒト幹細胞由来の網膜色素上皮細胞の効率的な凍結保存のための詳細なプロトコルを提供します。

要約

ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来する網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性疾患の個人における細胞補充療法のための優れた細胞源です。しかし、これらの治療細胞の安定的かつ安全なバンキングに関する研究は少ないです。凍結保存後のRPE細胞の非常に変動する細胞生存率と機能回復は、最も一般的に遭遇する問題です。本プロトコールでは、元の実験条件に基づいて凍結に最適な細胞相を選択することで、解凍後の細胞回収率を最高にすることを目指しました。細胞は、5-エチニル-2′-デオキシウリジン標識アッセイを使用して決定された指数関数的段階で凍結され、融解後の細胞生存率と回収率が向上しました。融解後まもなく、長い分化プロセスとは無関係に、安定で機能的な細胞が得られました。ここで説明する方法により、hESC由来RPE細胞の保存と融解を簡便、効率的、かつ安価に行うことができます。このプロトコルはRPE細胞に焦点を当てていますが、この凍結戦略は他の多くの種類の分化細胞に適用することができます。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、網膜¹の適切な機能を維持するために必要な細胞の色素性単層である。RPEの機能不全と死は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、シュタルガルト病など、多くの網膜変性疾患と密接に関連しています^2,3。RPE補充療法は、これらの疾患に対する最も有望な治療レジメンの1つです4,5,6,7。細胞治療には、ドナーRPE細胞の安定供給が不可欠です。ヒト胚性幹細胞(hESC)由来のRPE細胞は、初代RPE細胞の機能を模倣し、理論的には無制限の供給を生産できるため、細胞治療に理想的な細胞源です⁸。しかし、分化プロセスは面倒であり、得られたRPE細胞の貯蔵寿命は、その後の上皮間葉転換(EMT)のために比較的短いです。したがって、hESC由来RPE細胞の凍結保存は、長期保存および^{オンデマンド配布9}に必要な必須ステップである。

凍結保存による細胞損傷は、治療効果を不注意に損なう可能性があります^10,11。したがって、凍結保存に関する最近の研究では、細胞療法を設計する際には最適な極低温保存条件を決定するべきであると提案されている¹²。凍結保存が成功すると、凍結融解サイクル後の効率的な細胞回収、高い生存率、および細胞機能の回復が保証されます。しかし、哺乳動物細胞の接着単層の凍結保存に関する以前の研究では、融解後の生存率が非常に変動する(35%-95%)ことが報告されています13,14,15。多くの要因が凍結保存の結果に大きく影響し、特に凍結段階^16,17に影響を及ぼします。最近の研究では、異なる時点で凍結したRPE細胞は、融解後の回復にばらつきがあることが示されました¹⁷。私たちの知る限りでは、幹細胞由来RPE細胞の最適な凍結時間枠の決定に関する研究は不足しています。異なる研究では、細胞はさまざまな段階で凍結されました:一部の細胞は継代直後またはコンフルエントまたは色素沈着の前に凍結されました^8,15,18、他の細胞は他の時点で凍結されました^9,19,20,21。さらに、凍結保存に用いるRPE細胞の相や病期が融解後のRPE機能に影響を与えるかどうかについては、明確なエビデンスはありません。私たちの以前の研究では、細胞増殖の指数関数的段階(P2D5)が、細胞生存率と細胞の特性と機能の回復の観点から、hESC由来RPE細胞の凍結保存に最適な段階であることを初めて示しました¹⁷。

ここで確立した方法は、hESC由来のRPEを最適な段階で凍結保存することで、融解後の細胞生存率と機能において最高の保存を実現することを目的としています。凍結保存前のDNA合成の指数関数的段階を検出するために5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)標識アッセイを用いて、解凍したRPE細胞は、>80%の生存率と付着率、RPE特異的遺伝子発現、分極した細胞形態、色素上皮由来因子分泌、適切な経上皮耐性、および食作用能力を示した^8,17,22.このプロトコールはhESC由来のRPE細胞に焦点を当てており、すべての治療細胞が等しく凍結保存されているわけではありませんが、指数関数的段階で凍結する戦略は、他の多くの治療細胞に適用することができます。

プロトコル

1. 細胞の解離

1. RPE細胞は、前述した^17,22と同様に維持する。
   注:すべての細胞は、プロトコルの期間中、5%_CO2 雰囲気中で37°Cで増殖します。
2. 37°Cの水浴で必要量のPBSと培地を調製し、細胞解離試薬を室温で置く。
3. 培養液を廃棄し、ウェルあたり1 mLの予熱したPBSでプレートを2回洗浄します。
4. 1 mLの細胞解離試薬を6ウェルプレートに加え、細胞を37°Cで15分間消化します。インキュベーション後、縮小して端部が光る細胞を顕微鏡で観察し、消化の終了を確認します。
   注:トリプシンベースの解離は、細胞生存率が低いため、推奨されません。
5. 1 mLピペットで10回静かにピペットを上下させて細胞を解離し、細胞懸濁液を予熱した培地(Y-27632なし)で1:10の比率で希釈します。次に、細胞を室温で250 × gで3分間遠心分離します。
6. 遠心分離後、上清を迅速に注ぎ出し、細胞ペレットを2mLの培養培地に穏やかに再懸濁し、ピペットで細胞を10〜15倍再懸濁します。
7. 40 μmのセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過してシングルセル懸濁液を取得し、細胞数を計算します。
   注:シングルセル懸濁液は、正確な細胞カウントと融解後の均一な細胞播種密度に不可欠です。

2. 凍結保存に最適な細胞ステージの決定

注:細胞の状態は分化方法と細胞株によって異なるため、異なる実験室で培養したRPE細胞の指数関数的段階は、凍結する前に決定する必要があります。

1. 基底膜マトリックス溶液のバイアル1本を氷上で4°Cで一晩解凍します。マトリックスを12 mLの冷たいDMEM/F-12に希釈し、よく混合します。ウェルごとにカバースリップを1枚追加し、24ウェルプレートの各ウェルに0.25 mLの希釈溶液をコーティングします。プレートを室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートしてから使用し、細胞をプレーティングする直前にコーティング溶液を吸引します。
   注:アリコート量の指示は、タンパク質濃度に基づいてロット固有であり、製品仕様書に記載されています。
2. ステップ1.7のRPE単一細胞を、1mLの培地中で10⁵/cm² の密度で基底膜マトリックスコーティングカバースリップに播種します。2〜3日ごとに培地をリフレッシュしてください。
3. 示された時点(継代後1、3、5、7、および11日後)で、RPE細胞を培地中の10μM EdUと24時間インキュベートします。マニュアルに記載されているように、反応カクテルで細胞を固定、透過処理、染色して、組み込まれたEdUを検出します。
4. 蛍光顕微鏡で5つのランダムフィールドから画像を取得し、EdU陽性細胞の割合を計算します。対応する EdU 正の比例-時間曲線をプロットして、成長曲線を生成します。次に、成長曲線に従って、各細胞株の凍結ウィンドウまたは指数関数的段階を決定します。
   注:再確立された六角形の細胞形態は、細胞が指数関数的段階を出ることを示しています。

3. 凍結保存

1. ステップ1.1から1.7に従い、消化時間が5分に短縮される以外は、細胞懸濁液を室温で3分間、250 × gで遠心分離します。
2. 遠心分離後すぐに注いで上清を廃棄し、細胞ペレットを凍結保存培地に2 × 10⁶ 細胞/mLの密度で穏やかに再懸濁し、1 mLの細胞懸濁液を1.2 mLの極低温バイアルに移します。
3. 極低温バイアルをすぐに冷凍容器に入れ、-80°Cで一晩凍結して-1°C/minの冷却速度を達成し、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。

4.解凍

1. 培地を37°Cのウォーターバスで温め、予熱した培地10 mLを15 mLチューブにプレフィルします。
2. 液体窒素貯蔵庫から直接採取した極低温バイアルを、自動解凍システムを用いて迅速に解凍します。
3. 0.5〜1 mLの予熱した培地を極低温バイアルに滴下して、凍結細胞が新しい環境に徐々に適応することを確認します。次に、1.5〜2 mLの細胞懸濁液を15 mLチューブ内の10 mLの培養培地に移し、細胞を250 × g で室温で3分間遠心分離します。
4. 遠心分離後すぐに注いで上清を捨て、ペレットを予熱した2 mLの培地に再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントし、標準的なトリパンブルー排除(0.4%トリパンブルー染色)を使用して回収率と生存率を決定します。
5. Y-27632を添加した培地(最終濃度:10μM)で、基底膜マトリックスコーティング表面上の細胞を10⁵ 生存細胞/cm² の密度で培養します。24時間後にY-27632を取り外します。
6. 付着率を決定するには、細胞を再度解離し、解凍後24時間で細胞の数をカウントします。

5. 最適な凍結フェーズの検証

1. ステップ2.4で決定した最適な凍結フェーズを検証するには、異なる時点で凍結したRPE細胞を解凍し、28日間培養します。qPCRおよび免疫染色分析のために細胞を採取し、前述のRPEマーカーの発現を評価します¹⁷。

結果

ここでは、P1D35のhESC由来RPE細胞を継代し、10⁵/cm²の密度で播種した。播種から1週間以内に、特徴的な六角形の形態と色素沈着は、遅延期(約2日)で失われました。RPE細胞は、指数関数的段階(約5日、 図1A)で六方晶の形態を徐々に再採用し、より多角形の形態で減速段階(約6日)に入った。細胞培養をさらに1週間続けた場合、細胞増殖は大幅に減少し、細胞間...

ディスカッション

本研究では、研究および臨床ニーズに対するhESC由来RPE細胞の成功した凍結融解プロトコルについて説明します。不死化RPE細胞株ARPE-19とは異なり、幹細胞由来のRPE細胞のように、適切な特性の上皮表現型と機能を持つRPE細胞は、凍結保存に対してより敏感です。適切に保存されていない場合、融解後24時間で残った細胞は32%未満でした¹⁷。凍結保存のタイミングは重要なパラ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049